猪伪狂犬病病毒抗体检测的研究进展

（湖南农业大学，长沙市，410128）

猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV)属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，水痘病毒属。猪为原始宿主，能引起幼猪出现发热、麻痹、昏迷等症状，在年轻仔猪中假性狂犬病可能导致高死亡率，而在成年猪中，感染仍以潜伏形式存在。成年猪，作为病毒载体，可能偶尔将病毒传播给易感染动物。其延迟和复发性感染可能影响胎儿和仔猪。因此需要快速诊断两者，临床表现为急性以及猪的伪狂犬病感染的潜在形式[1]。无母源抗体的新生仔猪死亡率更高；也可引起半数妊娠母猪出现流产、死胎等生殖障碍，不死者可康复。其中该病与血液单核细胞有很大关系，因为血液单核细胞具有用作PRV的载体细胞的能力。它也是确定这些细胞是否也在体内代表被感染的血液白细胞的最重要的亚群。已经有足够的证据证明单核细胞的表型变化可能影响对PRV的允许性感染[2]。

1 抗体检测意义

随着我国畜牧业的迅猛发展，动物免疫接种已经成为目前防御疫病的首选措施。给动物进行有效的免疫接种能产生一定的保护作用，从而防止疫病的侵入和蔓延。因此在畜禽生产过程中,在群体接种疫苗前后对抗体水平进行检测可以准确了解动物疫病发生、传播和流行情况，掌握养殖场的免疫抗体水平和动物疫病保护情况，从而更有效地采取防控措施。因此，做好动物免疫抗体检测工作有着十分重要的临床意义和经济意义。而且猪伪狂犬病病毒的抗体检测可以及时检测出发病猪，然后进行防治和隔离等措施使猪伪狂犬病得到控制，从而减少猪场的经济损失。除此之外，我们也可以通过抗体检测研制出更为有效的疫苗来提高用药效率，从而加强猪伪狂犬病的治疗效果。更有甚者，我们还可以通过检测猪的乳汁和胎盘血的抗体消长规律，分析出伪狂犬病病毒能否通过血乳屏障和血胎屏障，进而对猪伪狂犬病的防治做出贡献。

2 抗体检测必要性

猪伪狂犬病是一种由伪狂犬病病毒引起的高死亡率的急性传染病。该病属于第二类动物疫病，可垂直或水平传播并终生带毒。目前PRV基因缺失弱毒疫苗在我国的大规模的应用导致了猪伪狂犬病野毒的出现，而且猪伪狂犬病野毒更可能诱导或加剧呼吸道症状，也可能与断奶后的腹泻有关，并且还可降低猪机体对其他疫苗如猪瘟疫苗的体液免疫应答能力，抑制抗体水平的升高，而且在近几十年里受野生猪群数量的影响PRV血清阳性率明显增加[3]。为准确区分野毒感染猪和疫苗接种猪，及时淘汰强毒感染猪，防止免疫猪被误杀，急需加强伪狂犬病强毒鉴别诊断方法的研究与推广应用[4]。由于频繁引种和伪狂犬毒株的变异导致猪伪狂犬病受多种因素的控制，如注射疫苗、天气突变、管理不当等外界因素，稍有不当就会引起猪伪狂犬病的爆发，给养猪户带来巨大的经济损失，所以我们需要进行准确、快速的诊断。

3 抗体检测技术

目前已知的检测伪狂犬病病毒抗体的方法有很多种，但无论哪一种方法都不可能解决所有的问题，我们需要根据自己的检测目的选择最为合适的检测方法。

3.1 血凝试验

吴平等[5]建立了反向间接血凝(抑制)试验检测伪狂犬病的方法，该方法是利用抗体致敏红细胞在相应的抗原作用下，发生红细胞凝集的特性来测定抗原的。该实验实际操作时利用了单克隆抗体Mab3致敏的红细胞(SRC3)检测非PRV抗原的标本，结果发现SRC3对PRV产生的凝集作用是特异性的，此外该实验测定了82份NT阳性血清，RPHI的检出率为91.5%,漏检率3.5%，该方法与NT的符合率为94.4%，完全可以取代NT。此外廖文军等[6]建立了检测猪伪狂犬病病毒gE抗体红细胞凝集试验的方法也给PR的诊断带来很大帮助，该方法是利用伪狂犬病病毒具有凝集动物红细胞的特性设计的试验。用该方法检测PRV感染了的血清可以看到明显的凝集圈，而其他少数病毒的阳性血清检测时则没有出现凝集现象，充分验证了该方法的特异性。而且该方法与gE-ELISA诊断试剂盒相比，阴、阳检出符合率为100%，因该方法具有快速、简便的特点所以被认为是PR诊断的常用方法之一。

3.2 病毒分离鉴定

杨庆芳等[7]通过BHK-21细胞培养、病毒毒力滴定、中和试验、PCR检测病毒方法对猪伪狂犬病病毒的分离株进行了鉴定，充分验证了伪狂犬病病毒在BHK-21细胞中增殖而且盲传4代后就出现了细胞病变；还用BHK-21细胞准确测定了其毒价TCID50,利用中和试验鉴定时发现病毒能被PRV标准阳性血清中和,利用PCR体外扩增后发现扩增片段与预期目的条带一致。实验现象和实验结果验证了该方法是成立的，为伪狂犬病病毒的治疗和诊断做出了很大贡献。

3.3 中和试验

微量中和试验是利用荧光抗体染色法进行的，其特异性强、敏感度高的特点倍受人们的青睐，在美国及其它一些国家还被列为法定的检测方法。方六荣等[8]应用了微量中和试验进行了猪伪狂犬病血清学调查，该方法对毒价（TCID50）、中和效价和中和指数进行了测定，得出的结果与目前普遍认为的中和效价为1∶2以上、中和指数为316以上的血清为阳性相附合，而且从发过病的猪场均检出了阳性血清，从未发病的4个猪场检出的血清均为阴性，继而证明了微量中和试验检测伪狂犬病病毒抗体的可靠性和准确性。此方法的建立与应用给伪狂犬病病毒的诊断带来了很大希望。

3.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）

酶联免疫吸附试验优点是检测时间短、灵敏度高，非常适用于大批量样品的检测，是实验室常用的抗体检测方法之一。苗得园等[9]建立了单抗夹心LAB-ELISA检测猪伪狂犬病病毒的研究，使得ELISA检测法得到了升华，将种特异性单抗和生物素-亲和素系统引入其中，进一步提高了该方法的特异性和敏感性。而且LAB-ELISA不与其他常见的病原体发生反应，具有良好的特异性，为伪狂犬病病毒的诊断提供了很大帮助。相继唐勇等[10-11]建立了gG-LAT和gE-LAT检测伪狂犬病病毒的方法，该研究分别切除了gG和gE基因NotI下游514bp的片段，结果gG和gE基因上游SacI-NotI片段在大肠杆菌中获得了表达且表达产物具有抗原性，从而建立了gG-LAT和gE-LAT检测猪伪狂犬病病毒的方法。该方法操作简单、耗时短，是目前唯一一种区分gG和gE基因缺失疫苗免疫猪与自然感染猪的方法，也为伪狂犬病的治疗打下了基础。除此之外唐勇等[12-13]还建立了猪伪狂犬病gE-ELISA和gGELISA鉴别诊断方法，该研究分别应用gE与gG基因工程表达产物成功地建立了gE-ELISA和gGELISA,用该方法与PRV的病理诊断及PCR诊断方法同时检测,结果发现该方法的诊断效果介于病理诊断与PCR诊断之间，该方法特异性好、敏感性高，可以应用于临床。与gG-LAT和gE-LAT检测法一样可以区分gG和gE基因缺失疫苗免疫猪与自然感染猪，为伪狂犬病的根除计划提供了有利条件。祁小乐等[14]建立了猪伪狂犬病病毒单抗双夹心ELISA，使ELISA得到了升华。该研究通过对PRV不同毒株、PRRSV等不同病毒进行交叉试验以及特异性阻断实验，充分证明了该诊断方法具有良好的特异性。而且该种方法选用可拆卸式聚苯乙烯板，各个孔之间相互独立从而解决了外围孔OD值偏高的问题，保证了检测结果的准确性。汪招雄等[15]通过将猪伪狂犬病病毒(Prv)Ea株特异性单克隆抗体576株作为捕获抗体，纯化的抗Prv lgG为检测抗体从而建立了检测Prv抗原的双抗体夹心ELISA法,在研究过程中，他们做了很多验证性试验，结果发现该方法比PCR准确性还要高，而且也不产生交叉反应，操作简单，耗时短，非常适用于临床诊断。最近，雷有玲等[16]通过利用原核表达技术表达猪伪狂犬病毒gE蛋白，以纯化的重组面蛋白为包被抗原建立了检测猪伪狂犬病毒野毒抗体的间接ELISA方法，优化了ELISA的反应条件。本研究做了一系列的交叉试验、重复性试验和符合性试验，确定了该方法的特异性和准确性，为PRV的抗体检测提供了一种快速、准确的血清学检测方法，非常适合在基层应用。

3.5 聚合酶链式反应(PCR)

因聚合酶链式反应（PCR）检测法灵敏度高、特异性好，所以被广泛使用。但做PCR时我们需要注意的是采集的病料必须是3周内没有接种过伪狂犬弱毒疫苗的猪，以免造成误诊。在科研人员的不懈努力下，渐渐出现了多重PCR和套式PCR，对猪伪狂犬病的诊断提供了很大帮助。刚开始的时候，娄高明等[17]发现血清学检测和病毒分离鉴定都存在一定的误差，然后他们利用PRV的原理，通过计算机分析设计并合成了1对用于扩增伪狂犬病病毒gB基因281bp片段的引物，然后PRV闽A株细胞培养毒为模板，筛选最佳反应条件和试剂工作浓度从而建立了检测伪狂犬病病毒的PCR法。该方法使用的引物可大量合成并长期保存，检测速度快，结果准确，而且可以在实验室不能持续提供细胞、样品中没有感染性病毒存在等许多情况下使用。除此之外，还为分子生物学技术检测伪狂犬病病毒打下了坚实的基础。为了更早的诊断出伪狂犬病，孙彦琴等[18]建立的猪流行性腹泻病毒与猪伪狂犬病病毒二重RT-PCR检测方法，可在早期诊断出伪狂犬病，以便及早采取措施控制疫病的蔓延，给猪场减少了很多损失。而且只需要一次反应就可以同时鉴别出PED和PR两种疫病，为疫病的诊断节省了不少时间和开支，适合广泛使用。继而为了更好的完善PCR检测法，吕建强等[19]建立了伪狂犬病病毒实时荧光PCR检测法，特异性特别高，只能检测到目标病毒，非常适合于基层防疫部门应用。此外，由于该方法可以定量检测到病毒DNA，这将为研究病毒的入侵途径、在宿主细胞内的增殖以及潜伏和复发机制等提供很大帮助，从而有利于进一步研究伪狂犬病病毒的传播途径和致病机理。吕素芳等[20]建立了一种快速、特异的方法检测伪狂犬病毒gE基因缺失病毒株，本研究根据PRV野毒sA株的gD和gE基因序列设计引物，对反应条件进行了优化从而建立了检测伪狂犬病病毒gE基因缺失病毒株的sYBR Green I实时定量PCR法。本研究还做了特异性试验、敏感性试验和重复性试验，从而验证了该方法的特异性、敏感性和准确性，发现其敏感性比传统的PCR检测法要高100倍，非常适用于猪群中伪狂犬病流行的诊断。吴旭锦等[21]根据伪狂犬病病毒gD基因序列设计并合成了2对引物，通过反应体系和条件的优化建立了套式PCR方法。该方法比国际方法的灵敏度高1 000倍，可以很容易的检测出病毒含量低的病料，对临床诊断提供了很大帮助。顾阳等[22]根据猪伪狂犬病病毒gE、gH的基因序列设计合成了2对特异性引物,分别建立gE和gH基因的单项PCR扩增方法，通过对PCR扩增条件的优化,建立了鉴别PRV强毒和疫苗毒的双重PCR检测方法。该方法具有特异性和敏感性高、检测成本低,能快速检测和鉴别多种病原的特点，而且还能够区别感染动物和疫苗接种动物，适合于挑选出阳性野毒感染动物，有望在临床诊断方面得到广泛应用。

3.6 环介导等温扩增（LAMP）

杨睿等[23]采用LAMP技术建立了一种针对伪狂犬病病毒的可视、快速、灵敏、特异的检测方法。应用PrimerExplorerV4软件,根据伪狂犬gE基因的保守序列设计了4条引物,优化了反应体系与反应时间,检测了特异性与灵敏性。发现该方法只需要40min就能检测出结果,具有良好的特异性,灵敏度为普通PCR的100倍,最低可检测出质量浓度为6.2×10～9mg/L的病毒DNA。该方法的建立为伪狂犬病的快速诊断提供了新的思路。

4 抗体检测应用

抗体检测首先可以应用在协助临床诊断方面，例如可以检查是否患病，也可以作为疾病治疗后的一个指标，还可以作为对预防接种效果的一种观察。在抗体检测用于诊断时，要考虑到患者所在地区该疾病的发病情况及与该疾病密切相关的情况，如正常人血清中抗体的水平，这一点在病原微生物感染的疾病中尤为重要。然后抗体检测也可以应用在实验室，我们可以利用抗体检测的结果研究其消长规律，从而研究出更高效的疫苗或者从中探索出更为有效的防控措施。抗体检测还可以应用在养殖场方面，例如根据抗体的消长规律可以更合理有效的用药，有时候还可以及时对发病猪进行隔离，从而降低猪场的损失。

5 讨论与小结

据报道猪伪狂犬病在国内很多个省市流行，而且该病在中国的流行呈逐渐严重的形势。尽管在规模化猪场普遍采用伪狂犬病基因缺失疫苗进行预防，但终究是防不胜防。近年来，很多规模化且进行过疫苗防治的猪场还是被检测出了伪狂犬病，这一现象对中国的养殖行业无疑是重大的挑战。因此，在疫苗的生产和保存等方面仍需要改进以提高疫苗的质量和构建新的缺失突变株疫苗成为今后的发展方向。此外，探索出更为快速、准确、灵敏的诊断方法也是非常有必要的。随着现代科技的不断发展和研究团队的日益增加，我相信不久的将来我们将攻克这一难题。