女性人乳头瘤病毒感染的基因型分布及临床意义

陈静 徐晶晶 何淑珍 秘相平 王文河

·论著·

女性人乳头瘤病毒感染的基因型分布及临床意义

陈静 徐晶晶 何淑珍 秘相平 王文河

目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV)感染的基因型分布情况及临床意义。方法 采用基因芯片技术对134例患者宫颈上皮细胞标本进行23种基因型别的检测，并对受检者进行相关资料分析。结果 134例患者进行23种HPV基因分型检测，HPV感染阳性患者60例，感染率44.78%(60/134)，其中单一型HPV感染率为30.60%(41/134)；多型HPV感染率为14.18%(19/134)；除HPV73型没有感染外，其余22种型别均有感染。结论 单一型HPV16型和单一型HPV58型是HPV感染的主要基因型别。基因扩增芯片技术一次可检测23种基因型，特异性强，敏感性高，对女性HPV感染基因型分布的病因学研究具有重要意义。

人乳头瘤病毒(HPV);基因分型;基因芯片技术

宫颈癌是目前人类所有癌症中唯一病因明确的癌症，也是第一个可防、可控、可干预治疗的癌症[1-3]。宫颈癌的发生与HPV感染的关系十分密切，HPV是一种专门感染人表皮和黏膜鳞状上皮的病毒，传播途径以性行为为主，其次是唾液和皮肤接触[4]。现研究已证实，高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是诱发宫颈癌的主要因素[5-8]。现采用基因扩增及基因芯片检测技术，对宫颈上皮细胞标本进行23种常见的HPV基因型检测，以了解HPV感染和基因型分布的情况，以此分析HPV与宫颈癌发生发展关系，为宫颈癌的干预治疗，HPV疫苗及试剂的研发提供数据资料和参考[9]。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2012年9月30日至2015年9月30日，因阴道分泌物异常或接触性出血在我院自愿进行HPV基因分型筛查的患者134例，年龄21～64岁，平均年龄(40±4)岁。均已婚，72 h内无阴道用药及性生活，对其基因分型结果进行分析。

1.2 仪器与试剂 核酸扩增实时荧光检测系统Applied Biosystems Step One Plus 基因扩增仪由杭州辉图生物科技有限公司提供；分子杂交仪由杭州奥盛仪器有限公司提供；TGL-16台式高速冷冻离心机购自湖南湘仪实验仪器开发有限公司；干式恒温器由杭州奥盛仪器有限公司提供；试剂储存冰箱购自青岛海尔特种电器有限公司；微型混合器由海门市其林贝尔仪器制造有限公司提供；微型离心机由海门市其林贝尔仪器制造有限公司提供，移液器由赛默飞世尔(上海)仪器有限公司提供。HPV分型基因测试盒购自珠海赛乐奇生物技术有限公司。每次试验时需当时配制洗脱液，所需要的浓度均使用蒸馏水调配。

1.3 方法

1.3.1 标本的采集及保存:月经正常女性，月经来潮后10～18 d为最佳检查时间；检查前48 h内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物；检查前48 h最好不应有性生活；检查前不进行醋酸或碘液涂抹。由医生以扩阴器暴露宫颈口，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去。将宫颈刷伸入宫颈口处，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转3～5圈。慢慢取出宫颈刷，将其放入装有细胞保存液的样本管中。在管口处将多余的刷柄折断，将刷头留在样本管中。旋紧管盖，并注明编号和日期。样本保存后，如若不能马上检测，应将样本置于4℃存放，并在2周内完成检测。应避免保存细胞样本反复冻融。

1.3.2 DNA的提取:震荡混匀临床标本，使宫颈刷上的宫颈脱落细胞尽量多的溶解在保存液中，取1 ml转移至1.5 ml离心管中(如果发现样本有渗漏，要先用卫生纸擦干)(转管后换手套)；12 000 r/min，离心10 min，弃上清，留沉淀(宫颈脱落细胞比重大，获取宫颈脱落细胞，HPVDNA存在于脱落细胞中。上清液使用1 ml移液枪移除；加50 μl样本处理液(如果能固定样本处理液，开一个加一个。如果不能固定，3个3个的加，不要一次性全部开盖，然后一次性加完)震荡混匀，在金属浴中100℃加热10 min(裂解脱落细胞的蛋白质外壳，便于HPVDNA能游离出细胞；样本处理液每次加样时要充分混匀，保证取样中含有均匀的树脂颗粒)；加热后12 000 r/min，离心10 min，目标DNA片段在上清，备用；阳性对照、阴性对照融化后可直接使用。由于不同原因，有些临床样本中含有太多的血液，因为血红蛋白的存在对PCR系统，特别是对Taq酶的催化效率有影响，所以如果不加以控制，可能对后面的诊断结果有影响，出现这种情况的处理方法是将细胞保存管在震荡器上震荡时间长些，吸取1 ml临床样本，离心收集细胞后，再用灭菌的0.9%氯化钠溶液漂洗1次。由于患者有不同程度的妇科炎症，加上部分医生取样不规范，可能会导致提取前的临床样本黏度太大，影响操作。处理方法是将细胞保存管在震荡器上震荡时间长些，不要取黏液，将取样刷头去除，吸取瓶底部液体，另要求医生在取样时尽量规范。

1.3.3 PCR扩增:取出直用型PCR反应液，在室温下融化并2 000 r/min离心10 s备用。按顺序放置，取上述制备的样本上清液10 μl，按顺序加入上述PCR管中；取10 μl模板之前，更换手套。取10 μl DNA模板，获取有效的DNA，便于扩增到有效的DNA产物。操作过程尽量迅速，能更有效的避免气溶胶污染。将上述PCR扩增管2 000 r/min离心10 s，避免管壁挂珠；按照以下条件进行扩增：50℃ 2 min，95℃ 15 min，94℃ 30 s，45℃ 1 min，72℃ 30 s，进行50个循环；72℃延伸10 min后，4℃密封保存备用。

1.3.4 杂交、孵育和显色:将杂交液，BW反应液取出，融化；将100×洗涤液A和200×洗涤液B稀释成1×工作液，全自动基因芯片检测系统使用前调试。揭开芯片保护膜，取 20 μl PCR 扩增产物加入至芯片表面，然后取100 μl直用型杂交液(提前10 min左右从冰箱拿出，室温融化)加入芯片表面，混匀；覆盖芯片表面；加样后的芯片在45℃杂交仪上杂交45 min，然后在室温下放置5 min，使其冷却至室温(能确保HPVDNA分子能够有效的与探针结合)；用预热至(50±1.5)℃的1×洗涤液A在自动洗脱仪内进行洗脱，浸泡洗脱2 min；用离心机将芯片表面液滴吹干。取直用型BW反应液适量(100～110 μl)覆盖于芯片表面，并在35℃下反应15 min(BW反应液中的亲和素一端与结合好HPVDNA分子的探针上的生物素进行有效的结合)；用预稀释的1×洗涤液B(室温)，洗涤芯片3次；用离心机吹干芯片表面；将直用型显色液2～3滴(100～110 μl)滴加在干燥的芯片表面，并使其覆盖全片，避光35℃下反应10 min；用预稀释的1×洗涤液B迅速冲洗芯片3次，离心机吹干芯片表面后即可观察结果。

2 结果

2.1 HPV基因分型检测结果 134例患者进行23种HPV基因分型检测，阳性60例，阴性74例，HPV感染率44.78%(60/134)，其中单一型HPV感染41例，占总感染率的30.60%(41/134)；多型HPV感染19例，占总感染率的14.18%(19/134)，提示以单一型HPV感染为主。除HPV73型没有感染外，其余22种型别均有感染。单一型感染中HPV16型和HPV58型均有5例，是主要的感染型别；其次是HPV51型4例；再次HPV33、HPV52、HPV53、HPV56各3例；HPV6、HPV11、HPV18、HPV68各2例；二型感染8例：HPV53、6，HPV6、43，HPV45、58，HPV52、59，HPV6、58，HPV16、81，HPV16、58，HPV16、6；三型感染7例：HPV52、11、42，HPV31、51、53，HPV33、52、56，HPV53、66、6，HPV35、52、53，HPV11、51、56，HPV6、16、35，四型感染1例：HPV31、33、59、83，五型感染2例：HPV33、51、52、6、43，HPV52、53、56、58、6；还出现了1例罕见的八型感染：16、31、33、35、59、68、82、83。其中HPV35、82、83型只出现在多型感染中。60例HPV阳性患者检出不同型别数合计88次，对多重感染者，各型别的阳性率重复计算[5]。

2.2 不同年龄HPV型别感染情况 20～29岁、30～39岁、40～49岁和50～60岁4组HPV阳性患者数比较，40～49岁最多46例，20～29岁最少只有6例，由此可见40～49岁是HPV易感年龄段，60例患者不同年龄段HPV型别感染情况。见表1。

3 讨论

有研究显示，宫颈癌及其癌前病变主要是HPV感染引起的，宫颈癌患者中99.7%的人均能检测到HPV DNA，全球超过2/3的宫颈癌病例是由高危型HPV感染引起[10-13]。另有报道表明约80%以上有性行为的女性在其一生的某个阶段都曾感染过HPV，绝大数的感染者在感染后1～2年均能自行消退，只有极少数持续HPV感染，从而诱发宫颈上皮恶性转化导致宫颈癌的发生[7,14]。

本研究表明：(1)134例患者进行23种HPV基因分型检测，HPV感染率为44.78%(60/134)，其中单一型HPV感染率的30.60%(41/134)；多型HPV感染率为14.18%(19/134)；提示以单一型HPV感染为主。单一型中HPV16型和HPV58型感染为主；其次是HPV51型，多型感染以二型感染为主，且除HPV73型没有感染外，其余22种型别均有感染。所有88人次HPV感染的患者中有83例都伴有高危型HPV感染，感染率94.32%(83/88)。(2)女性生殖道存在着一条HPV感染通道，宫颈是其通道中HPV感染最高的部位，也是最易感部位[15]。(3)88次不同型别HPV感染的患者中，除一位感染HPV11型的患者是64岁以外其他患者均≤60岁。20～29岁占6.8%(6/88)、30～39岁占22.7%(20/88)、40～49岁占53.4%(47/88)、50～60岁占17.1%(15/88)。提示HPV感染主要集中在40～50年龄段[16]。此年龄段女性开始进入围绝经期，是正常的生理变化时期，泌尿生殖系也发生改变，生殖器官开始萎缩，黏膜变薄，此时的宫颈比较容易被感染，处于这个年龄段的女性应定期筛查HPV。(4)本研究为HPV感染的预防、治疗，疫苗和诊断试剂的研发以及分子流行病学调查提供理论依据。目前与宫颈癌相关的其它高危因素也比较明确，主要有过早或不洁的性行为，分娩因素及性传播疾病导致的宫颈炎对宫颈的长期刺激等，对于有上述高危因素的女性，应尽量进行HPV分型检测[17]。

表1 60例患者不同年龄段HPV型别感染情况 例

注：1例64岁患者仅感染HPV11型

综上所述，HPV检测技术可了解患者是否存在与宫颈癌关系密切的HPV感染[18]。通过宫颈上皮细胞HPV基因型检测，宫颈细胞学检查及宫颈活组织检查等，已使很多国家的女性宫颈癌的发病率呈下降趋势。总之，在宫颈癌及癌前病变的筛查中，HPV分型检测发挥了重要的意义[19,20]。

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253800 河北省故城县医院

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