沉默KLF4表达对人肝星状细胞HSC-LX2生物学行为的影响

李涛 牛丽娟 刘文宣 杨磊 李曼 曹丹丹 彭乱顺

·论著·

沉默KLF4表达对人肝星状细胞HSC-LX2生物学行为的影响

李涛 牛丽娟 刘文宣 杨磊 李曼 曹丹丹 彭乱顺

目的 筛选有效沉默KLF4基因表达的siRNA，观察KLF4基因沉默对人肝星状细胞HSC-LX2生物学行为的影响。方法 设计并化学合成针对人KLF4基因的3对siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)，转染人肝星状细胞HSC-LX2，以转染非特异siRNA作为阴性对照。采用实时荧光定量RT- PCR(Real-time RT-PCR )和Western blot方法分析KLF4 mRNA和蛋白的表达情况，筛选出沉默KLF4效果最好的1个siRNA,将其转染入HSC-LX2后，用MTT法检测KLF4沉默对HSC-LX2增殖的影响。采用ELISA法检测细胞培养上清中的转化生长因子1 (transforming growth factor，TGF-1)、白介素1(interleukin-1，IL-1)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表达情况。结果 Real-time RT- PCR和western blot均显示siRNA3沉默效果最好。故后续试验均采用siRNA3沉默KLF4的表达。MTT实验结果显示，在转染siRNA3，12 h、24 h和48 h后，细胞活力出现明显下降。ELISA结果显示，转染siRNA3，48 h以后，TGF-β1、TNF-α、IL-1β表达量也明显降低。结论 siRNA3可有效沉默KLF4基因表达，KLF4基因沉默可以抑制HSC-LX2的增殖，影响其生物学行为，使细胞中的促进胶原表达的三种细胞因子TGF-1、TNF-α以及IL-1表达量下降。

人肝星状细胞；KLF4；转化生长因子β1；肿瘤坏死因子α；白介素1

肝纤维化过程中，肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活是其核心环节。各种因素通过不同方式和途径作用于肝脏中的HSCs，导致其生物学行为及功能变化，引起肝纤维化[1]。因此，如果能够抑制HSCs的行为和功能变化，就可以减轻甚至逆转肝纤维化。KLF4是Krüppel样因子(Krüppel-like factors，KLFs)家族的重要成员，具有调节某些细胞的增殖、分化以及凋亡等重要功能[2]。KLF4是否会对HSCs的细胞生物学行为产生影响，目前还缺乏此方面的研究。本研究观察沉默KLF4表达是否可以抑制HSCs的行为和功能变化，减少其致纤维化的细胞因子转化生长因子β1(transforming growth factor,TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素1(interleukin-1，IL-1)的分泌。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 人肝星状细胞HSC-LX2购自中南大学湘雅医院细胞中心；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青链霉素购自美国GIBCO公司；Liprofectamine 2000、Trizol reagent购自美国Invitrogen公司；SYBR Green Real-Time试剂盒购自北京百泰克公司；M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒购自美国GeneCopoeia公司；TGF-β1,IL-1β，TNF-α ELISA试剂盒购自上海ExCellBio 公司；兔抗人KLF4、兔抗人β-actin单克隆抗体购自美国epitomics公司；IRDye800 Anti-Rabbit IgG购自美国Rockland公司。

1.2 方法

1.2.1 沉默人KLF4基因siRNA序列的设计:参考Genebank中人KLF4基因序列，依据siRNA设计原则选取三条可能的序列作为目标序列。同时设计一条与人KLF4 mRNA无同源性的siRNA作为阴性对照。交由上海吉玛制药技术有限公司合成。见表1。

表1 siRNA序列

1.2.2 细胞培养:在37℃，5%CO2培养箱中，用含12%胎牛血清的DMEM培养基常规培养HSC-LX2细胞。当细胞生长至合适汇合度时用0.25%胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养，待细胞处于对数生长期时用于实验。

1.2.3 siRNA转染细胞:采用细胞悬液法进行转染，于转染当日，将对数生长期HSC-LX2细胞制成细胞悬液。根据lipofectamine 2000的Protocol分别配置A、B液。A: 250 μl Opti-MEM+5 μl siRNA，室温静置5 min,B: 250 μl Opti-MEM+5 μl Lipfectamine 2 000混合，室温静置20 min。将6×105个细胞/孔细胞悬液与转染混合物分别加入35 mm的小皿中，培养液补齐体积至1.5 ml。 5% CO2,37℃培养箱培养，12 h后换液。分别于转染后24 h和48 h提取细胞RNA和蛋白检测KLF4沉默效果以及细胞生物学行为检测。

1.2.4 Real time RT-PCR检测HSC-LX2中KLF4 mRNA表达:转染siRNA 24 h后用PBS清洗细胞，每孔加入1 ml Trizol，充分裂解，将裂解液转至EP管中，加入200 μl氯仿；4℃，12 000 r/min离心15 min，把上层无色液相移入新的EP管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置30 min；4℃，12 000 r/min离心10 min，弃上清；加入1 ml 75%乙醇，洗涤沉淀；4℃，5 000 r/min离心3 min，倒出液体；室温晾干，加入DEPC 水20 μl溶解。将细胞总RNA 2 μg，采用M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒进行反转录，使用SYBR Green Real-Time试剂盒，对反转录所获得的cDNA进行Real time RT-PCR检测，选取2 μl cDNA于20 μl反应体系中进行反应，反应在Rotor-GeneTM 6000(Corbett)中进行，循环条件为94℃ 5 min，94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s 共35个循环。以GAPDH作为内参基因，采用Primer 3.0软件，设计所需片段的扩增引物，由华大基因公司合成与纯化，序列如下:人KLF4上游引物序列：5’-ATCTTTCTCCACGTTCGCGT-3’下游引物序列：5’-GGAAGTCGCTTCATGTGGGA-3’；人GAPDH上游引物序列：5’-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3’下游引物序列：5’-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT -3’。每个样本重复3次，取平均值为Ct值，用仪器自带软件进行荧光定量分析，计算出△Ct值，采用相对定量2-ΔΔCt法比较目的基因mRNA的表达变化。

1.2.5 Western blot法检测HSC-LX2中KLF4蛋白表达:转染siRNA 48 h后用PBS清洗细胞，加入适量RIPA裂解液，用细胞刮收获细胞裂解物，移入EP管；离心，12 000 g,15 min，取上清液加入2×loading buffer，100℃煮沸5 min，取上清待用。取细胞总蛋白80 μg，经10% SDS-PAGE凝胶120 V电压进行电泳分离，之后电转移至PVDF膜上，将PVDF膜置于5%脱脂奶粉(0.05%TBST配制)中封闭1 h，分别加入兔抗人KLF4 (1∶500稀释)，兔抗人β-actin(1∶3 000稀释)孵育PVDF膜，4℃过夜。TBST洗膜3次，每次10 min。利用TBS配制的红外染料标记的二抗 IRDye800 Anti-Rabbit IgG(1∶15 000稀释)孵育PVDF膜，室温1 h。TBS洗膜3次，每次10 min。利用Odyssey扫描仪对PVDF膜进行扫描显影并保存图像。

1.2.6 MTT法测定细胞活力变化:收集对数期细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度104/ml，加入96孔板，每孔加入100 μl，边缘孔用无菌PBS填充，5% CO2，37℃孵育，过夜培养，转染干预结束后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5% MTT)，置于培养箱中继续培养4 h。之后终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150 μl 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、转染试剂、培养液、MTT、二甲基亚砜)。细胞活力(%)=(实验组A490/对照组A490)×100%。

1.2.7 ELISA法检测HSC-LX2培养液中TGF-β1、TNF-a和IL-1β的表达:按照试剂盒要求，将细胞培养液1 000 g离心10 min，收集上清用于检测。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μl，余孔分别加标准品或待测样品100 μl，37℃温育2 h。 弃去液体，每孔加检测溶液A工作液100 μl，37℃温育1 h。弃去孔内液体，洗板3次， 每孔加检测溶液B工作液100 μl，37℃温育1 h。弃去孔内液体，洗板5次，每孔加底物溶液90 μl，37℃，避光显色，每孔加终止溶液50 μl，终止反应，用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度值。根据样品值，由标准曲线查出相应的浓度。

2 结果

2.1siRNA对HSC-LX2细胞KLF4的沉默效果 三条siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)以及阴性对照NcsiRNA分别转染HSC-LX2细胞24h后，应用Real-timeRT-PCR检测HSC-LX2中KLF4的mRNA表达情况。应用2-ΔΔCt法比较KLF4mRNA在各组HSC-LX2中的表达情况。以NcsiRNA组为对照组，则siRNA1组、siRNA2组和siRNA3组相对于对照组的KLF4mRNA的表达分别是(0.695±0.034)、(0.602±0.046)和(0.313±0.033)(P<0.05)。可见，siRNA3组对KLF4mRNA的沉默效果最好。采用相同方法转染HSC-LX2细胞后48h，应用westernblot法检测HSC-

LX2中KLF4的蛋白表达情况。与内参蛋白β-actin相比，3对siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)组KLF4 蛋白表达分别是(0.614±0.046)、(0.586±0.043)和(0.322±0.031)，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与mRNA的结果类似，siRNA3组对KLF4 蛋白的沉默效果最好。故后续实验均采用siRNA3沉默KLF4的表达。见表2，图1。

组别KLF4mRNA(2-ΔΔCt)KLF4蛋白(protein/β⁃actin)对照组1．006±0．0120．912±0．032siRNA1组0．659±0．034∗0．614±0．046∗siRNA2组0．602±0．046∗0．586±0．043∗siRNA3组0．313±0．033∗0．322±0．031∗

注：与对照组比较，*P<0.05

图1westernblot检测转染三种siRNA48h后HSC-LX2中KLF4的蛋白表达结果

2.2KLF4沉默对HSC-LX2细胞活力的影响siRNA3转染HSC-LX2细胞后，同对照组(细胞活力定义为100%)比较，MTT实验结果显示，在12h、24h和48h，siRNA3组细胞活力分别降为(75.56±3.56)%,(52.35±2.34)%和(50.14±2.41)%(P<0.05)。见表3。

组别12h24h48h对照组100100100NcsiRNA组101．25±1．35100．69±1．22101．56±2．31siRNA3组75．56±3．56∗52．35±2．34∗50．14±2．41∗

注：与NcsiRNA组比较，*P<0.05

2.3KLF4沉默对HSC-LX2细胞上清液细胞因子分泌的影响siRNA3转染HSC-LX2细胞48h后，收集细胞培养液，采用ELISA试剂盒检测，结果显示与对照组比较，TGF-β1表达量降到(52.42±8.14)pg/ml,TNF-α表达量下降到(35.16±4.11)pg/ml，IL-1β表达量下降到(41.34±5.73)pg/ml，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

组别TGF⁃β1TNF⁃αIL⁃1β对照组178．28±20．3148．41±5．4380．15±6．24siRNA3组52．42±8．14∗35．16±4．11∗41．34±5．73∗

注：与NcsiRNA组比较，*P<0.05

3 讨论

RNA干扰现象是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程[3]。细胞中的双链RNA特异性的核酸酶Dicer将双链RNA裂解成大约21个核苷酸组成的siRNA，然后siRNA作为媒介引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因转录后的表达，启动基因沉默机制。RNA干扰是目前相对成熟的靶基因沉默技术，可以高效、特异和持续的沉默细胞内靶基因的表达。虽然理论上任何21个核苷酸的mRNA序列都可以设计作为siRNA序列，但是他们的沉默效率相差很大。造成这样差异的原因很多，包括mRNA二级结构的修饰，结合能的大小等[4]。如果mRNA的二级结构非常复杂，则siRNA很难与其结合，则会严重影响siRNA的干扰效率。因此，针对靶基因的有效、特异的siRNA序列的选择是决定沉默效率的关键环节[5]。本研究中我们依据siRNA设计原则，设计了针对人KLF4mRNA序列从909到1 702位点的3个可能的序列(siRNA1、siRNA2和siRNA3)作为目标序列。同时设计一条与人KLF4mRNA无同源性的siRNA作为阴性对照。Real-timeRT-PCR结果显示siRNA1组、siRNA2组和siRNA3组相对于对照组的KLF4mRNA的表达都有明显下降，其中siRNA3组对KLF4mRNA的沉默效果最好。同样，westernblot的结果与Real-timeRT-PCR结果类似。所以，筛选出沉默KLF4效果最好的siRNA3。

KLF4在细胞的增殖、分化以及凋亡等方面发挥重要的调节作用[6]。根据细胞组织学类型的不同，KLF4起到促进或者抑制增殖的作用[7]。例如在结直肠癌，子宫颈癌，卵巢癌，胰腺导管癌，肺癌，膀胱癌，胃癌等的表达是降低的。而在乳腺癌，皮肤鳞状细胞癌等的表达却是增加的。并且，在肝细胞癌中的报道目前还存在争议[8]。所以，本部分研究沉默HSC-LX2中的KLF4表达，观察其对HSC-LX2增殖的作用。结果显示KLF4沉默可以抑制HSC-LX2的增殖活化，故可能减轻肝纤维化。HSC-LX2在肝纤维化过程中可以表达很多细胞因子，促进纤维化的进展。例如TGF-β1、TNF-α、IL-1β等，这些细胞因子在纤维化的发生以及炎性反应的持续方面发挥了重要的作用。TGF-β1是目前公认的最重要的致纤维化因子[9]。研究显示抑制TGF-β1的表达，可以明显改善纤维化动物模型的纤维化程度。TGF-β1基因敲除鼠与正常对照鼠比较，在慢性肝损伤中ECM的合成明显减少[10]。虽然在肝脏中kupffer细胞，胆管细胞等都能分泌TGF-β1，但是HSC-LX2自分泌的TGF-β1在肝纤维化中的作用更加明显[11]。本研究显示KLF4基因沉默可以明显减少HSC的TGF-β1分泌。TNF-α和IL-1β是重要的促炎因子，研究显示减少TNF-α的表达，可以显著改善各种原因导致的动物模型的肝损伤程度[12]。此外，IL-1β可以保护TGF-β1 和TNF-α不被蛋白酶水解，调节其生物活性和生物利用度，增加局部的炎性反应，因此促进慢性肝纤维化[13]。本部分研究也显示TNF-α和IL-1β的表达也有明显的减少，说明KLF4基因沉默可以减少HSC的TNF-α和IL-1β分泌，减少炎性反应，从而减轻肝脏的纤维化程度。

综上所述，通过沉默KLF4表达，可以抑制HSC-LX2的增殖，影响其生物学行为，使细胞中的促进胶原表达的三种细胞因子TGF-β1、TNF-α及IL-1表达量下降，减轻肝纤维化程度，为肝纤维化的防治提供了新的靶点。

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4Sciabola1S,CaoQ,OrozcoM,etal.ImprovednucleicaciddescriptorsforsiRNAefficacyprediction.NucleicAcidsResearch,2013,41:1383-1394.

5YoshinariK,MiyagishiM,TairaK.EffectsonRNAiofthetightstructure,sequenceandpositionofthetargetedregion.NucleicAcidsRes,2004,32:691-699.

6FerralliJ,Chiquet-EhrismannR,DegenM.KLF4αstimulatesbreastcancercellproliferationbyactingasaKLF4antagonist.Oncotarget,2016,7:45608-45621.

7HsuHT,WuPR,ChenCJ,etal.HighCytoplasmicExpressionofKrüppel-likeFactor4IsanIndependentPrognosticFactorofBetterSurvivalinHepatocellularCarcinoma.IntJMolSci,2014,15:9894-9906.

8YinX,LiYW,JinJJ,etal.Theclinicalandprognosticimplicationsofpluripotentstemcellgeneexpressioninhepatocellularcarcinoma.OncolLett,2013,5:1155-1162.

9LiangC,BuS,FanX.SuppressiveeffectofmicroRNA-29bonhepaticstellatecellactivationanditscrosstalkwithTGF-β/Smad3.CellBiochemFunct,2016,34:326-333.

10ShekFW,BenyonRC.Howcantransforminggrowthfactorbetabetargetedusefullytocombatliverfibrosis?EurJGastroenterolHepatol,2004，16:123-126.

11DropmanA,DediuliaT,Bretikopf-HeinleinK,etal.TGF-β1andTGF-β2abundanceinliverdiseaseofmileandmen.Oncotarget,2016,7:19499-19518.

12DiehiAM.TumornecrosisfactoranditsPotentialroleininsulinresistanceandnonalcoholiefattyliverdisease.ClinLiverDis，2004,8:619-638.

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Effects of silencing KLF4 expression on biological behaviors of HSC-LX2 in vitro

LITao*,NIULijuan,LIUWenxuan*,etal.

*DepartmentofEpidemiologyandHealthStatistics,PublicHealthCollege,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China

Objective To screen the siRNA which can effectively silence KLF4 expressions, and to observe the effects of KLF4 gene silence on biological behaviors of LX2 in human hepatic stellate cells (HSC-LX2).Methods The three pairs of siRNAs (siRNA1,siRNA2,siRNA3)targeting at human KLF4 mRNA were designed and chemically synthesized, then which were transfected into HSC-LX2. The expression levels of KLF4 mRNA and protein were detected by Real-time fluorescent quantitative PCR (Real-time RT-PCR) and Western Blot,respectively,with the nonspecific siRNA transfected into HSC-LX2 being regarded as negative control group. One of the siRNAs with the best effects of silencing KLF4 expression was selected,then which was transfected into HSC-LX2, the effects of KLF4 silence on cell proliferation of HSCs were measured by MTT.Moreover the expression levels of transforming growth factor (TGF-1),interleukin-1 (IL-1),tumor necrosis factor-α (TNF-α) in supernatant of cell culture were detected by ELISA.Results The examination results by Real-time RT-PCR and Western Blot showed that the silencing effect of siRNA3 was the best,thus,which was used in the subsequent experiments.MTT assay suggested that the cell vitalities were significantly decreased at 12h, 24h,48h after siRNA3 transfection, as compared with those in negative control group. ELISA assay showed the expression levels of TGF-1, TNF-α,IL-1 were obviously decreased at 48h after transfection, as compared with those in negative control group.Conclusion The siRNA3 can effectively silence KLF4 expression,and KLF4 gene silence can inhibit the cell proliferation of HSC-LX2 and can affect its biological behaviors to decrease the expression levels of TGF-1, TNF-α and IL-1.

human hepatic stellate cells; KLF4; TGF-β1；TNF-α；interleukin-1

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.07.005

项目来源：河北省医学科学研究重点课题(编号：20150627)

050017 石家庄市，河北医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室(李涛、刘文宣、杨磊、李曼、曹丹丹)；河北省石家庄市第三医院肿瘤科(牛丽娟)，老年病科(彭乱顺)

彭乱顺，050011 河北省石家庄市第三医院老年病科；

E-mail：litao771018@163.com

R 329.447

A

1002-7386(2017)07-0981-04

2016-01-19)