水产品中孔雀石绿和隐形孔雀石绿残留量的提取方法优化

范芳芳，李 晓，吴 坤，李 婧，石旭东

（陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安 710048）

水产品中孔雀石绿和隐形孔雀石绿残留量的提取方法优化

范芳芳，*李 晓，吴 坤，李 婧，石旭东

（陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安 710048）

在GB/T 19857—2005基础上，建立一种水产品中残留的孔雀石绿和隐形孔雀石绿的提取及富集的优化方法，并用高效液相色谱-紫外检测器的方法对目标物进行检测。考察了氧化铝、盐酸羟胺溶液和对-甲苯磺酸钠溶液、氯化钠、乙酸胺溶液及富集净化的方法等因素对水产品中孔雀石绿和隐形孔雀石绿的回收率影响。结果表明，5 g左右样品在用乙腈提取时，需加入2 mL质量分数为20%的盐酸羟胺溶液，1 mL浓度为1.0 mol/L的对-甲苯磺酸钠溶液，2 mL浓度为0.1 mol/L的乙酸胺溶液（用冰乙酸调节pH值至4.5），8 g酸性氧化铝，2 g氯化钠；采用此法目标物的回收率最高，其中孔雀石绿可达95.6%，隐形孔雀石绿可达101.2%。该法具有操作简单、回收率高、快速大批量处理等优点。

水产品；孔雀石绿；隐形孔雀石绿；高效液相色谱-紫外检测器法；回收率

0 引言

孔雀石绿（Malachite green，MG）又名孔雀绿、碱基绿，是一种具有金属光泽的结晶体，通常以氯化物或者草酸盐的形式存在，极易溶于水，水溶液呈蓝绿色[1]。在水产养殖业中，MG主要作为杀菌剂、驱虫剂、防腐剂来预防和治疗各类水产动物的水霉病、锶霉病及小瓜虫病等[2]。

近年来，研究发现MG具有毒性化学官能团三苯甲烷，对哺乳动物和人类具有致畸、致癌、致突变等作用，同时含有MG的废水排放会污染环境[3]。MG在鱼类等生物体内可迅速转化为隐形孔雀石绿（Leucomalachite green，LMG），该代谢产物毒性更大[4]。鉴于MG的危害性，美国、日本、英国等许多国家已禁止将其用于水产养殖业，我国也于2002年5月将MG列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，禁止用于所有食品动物[5-6]。

因此，加强对水产品中孔雀石绿及其代谢物的监测，对于打击违法犯罪、保障食品安全显得格外重要。

目前，对MG和LMG的检测主要采用液相色谱法[7]、分光光度法[8]、液相色谱质谱法[9]、液相色谱-质谱串联法[10]、毛细管电泳法[11]及酶联免疫法等[12]。样品的前处理是分析化学的瓶颈问题，也是检测误差的主要来源之一。乙腈对细胞组织具有良好的渗透性，能够去除蛋白释放的MG和LMG，因此试验的前处理采用乙腈作为基本的提取液[13]。关于这方面的研究也有很多，如Zhang Y等人[14]采用乙腈-醋酸胺混合液体系，而Ascari J等人[15]采用柠檬酸-乙腈混合体系来对MG和LMG进行提取纯化。试验在乙腈-乙酸胺溶液作为提取液的基础上，首次将无机盐氯化钠加入，然后乙腈和水形成的双水相[16]与旋蒸结合的富集纯化方法用于LG和LMG的富集纯化，其结果采用高效液相-紫外检测器（HPLC-UV）的方法进行检测。该法具有步骤简化、操作简单、回收率高、稳定性好等优点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

孔雀石绿（草酸盐）标准品和隐形孔雀石绿标准品均购自德国Dr.Ehrenstorfer Gmb H公司，其纯度分别为95%和98%，生产批号分别为20201和30103。

乙腈购自德国默克公司，色谱纯；试验用水为超纯水；所用试剂除指定外，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

2998 TDQ型高效液相色谱仪，美国Waters公司产品，配有二联泵、柱温箱、UV2487检测器、Waters色谱工作站；RE-52型旋转蒸发仪，上海之信仪器有限公司产品；TG16-NS型离心机，湘仪离心机公司产品；KQ-250DE型超声仪，昆山市超声仪器有限公司产品；JA1003N型天枰，上海佑科公司产品。

1.3 主要溶液的配备

孔雀石绿标准储备液：100 μg/mL，准确称取0.01 g孔雀石绿（草酸盐）标准品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容。

隐形孔雀石绿标准储备液：100 μg/mL，准确称取0.01 g隐形孔雀石绿标准品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容。

称取5.0 g左右不含MG和LMG的水产品粉碎样于50 mL容量瓶中，量取一定量乙腈进行混匀，经超声、离心后取上清液得到基质溶液。

各取0.5 mL MG和LMG的标准储备液于10 mL容量瓶中，用基质溶液定容至刻度线，配置成5 μg/mL的混合标准工作液。

配制0.1 mol/L的乙酸胺溶液，并用冰乙酸调节pH值至4.5。

配制浓度为1.0 mol/L的对-甲苯磺酸钠溶液和质量分数为20%的盐酸羟胺。

1.4 色谱条件

色谱柱：Waters C18-ODS柱（5 μm，4.6 mm× 250mm），柱后接25%的二氧化铅氧化柱；柱温：25℃；流速：1.0 mL/min；流动相：乙腈与0.1 mol/L的乙酸铵缓冲溶液（pH值4.5）体积之比为80∶20。

1.5 计算公式

目标物的回收率用E来表示，计算公式为：

式中：X2——加标样品中目标物的浓度，μm/mL；

X1——样品中目标物浓度，μm/mL；

X——加入的标准品浓度，μm/mL。

此计算公式适用于样品和加标样品质量相同的情况下。

1.6 试验方法

称取5.00 g水产样品于50 mL离心管中，加入15 mL乙腈，混匀，超声时间5 min。首先考察乙酸胺溶液对试验结果的影响；进一步研究氧化铝的属性对目标回收率的影响，并确定其最佳含量，以及与填充氧化铝柱子的萃取效果进行了比对；在此基础上，继续考察不同量的盐酸羟胺和对-甲苯磺酸钠溶液对结果的影响；在确定了提取方法后，试验对不同富集纯化方法进行比对；确定完上述参数后，继续研究氯化钠添加量对试验结果的影响，从而得到最佳试验方法。

1.7 标准曲线的建立

试验比较了Agilent的C18柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm）与Waters-ODS的C18柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm）分离情况。结果发现，后者对目标物的分离效果好、基线平稳、杂峰干扰少。于波长588 mm与618 mm处，孔雀石绿和隐形孔雀石绿在5.053 min和17.149 min时响应值最大。

5 μg/mL混合标准色谱见图1。

图1 5 μg/mL混合标准色谱

1.8 工艺优化试验说明

试验在GB/T 19857—2005[17]和目前报道的相关文献[18-19]的方法基础上，对盐酸羟胺和对-甲苯磺酸钠溶液的添加量、氧化铝的属性和添加量、乙酸胺溶液、氯化钠的添加量和富集净化方法等因素进行研究，首次将双水相技术[16]——无机盐氯化钠加入后乙腈和水形成的双水相与旋蒸结合的方法用于LG和LMG的富集纯化，其结果采用高效液相色谱-紫外检测器（HPLC-UV）的方法进行检测。

2 结果与分析

2.1 氧化铝对目标物回收率的影响

2.1.1 氧化铝的属性对目标物的影响

氧化铝对目标物回收率的影响见表1。

表1 氧化铝对目标物回收率的影响/%

由表1可知，酸性氧化铝能够使目标物的回收率大大提高，这是由于碱性氧化铝与目标物发生次级反应，而酸性氧化铝通过离子交换，可达到对MG和LMG的提纯净化作用[20-21]。

2.1.2 酸性氧化铝添加量对目标物回收率的影响

试验在2.1.1所述试验方法的基础上，继续考查分别添加2，4，6，8，10 g酸性氧化铝，对目标物回收率的影响。

酸性氧化铝添加量对回收率的影响见图2。

图2 酸性氧化铝添加量对回收率的影响

由图2可知，随着酸性氧化铝添加量的升高，目标物的回收率越来越高，当酸性氧化铝添加量为8 g时，目标物的回收率升至最高，分别为81.77%和85.09%；随着酸性氧化铝添加量继续增大，目标物的回收率降低。这是由于过量的酸性氧化铝中携带的过量阴离子会抑制MG和LMG向乙腈层的转移。

2.1.3 与过酸性氧化铝萃取的结果对比

试验将酸性氧化铝直接加入溶液中与滤液过酸性氧化铝萃取小柱2种方法的结果进行了比对，结果发现酸性氧化铝过萃取小柱MG和LMG的回收率分别为73.24%和78.99%，低于81.77%和85.09%。这是由于自制的氧化铝小柱紧密性不够，导致洗脱效果不好。

2.2 盐酸羟胺和对-甲苯磺酸钠对目标物回收率的影响

由于MG和LMG容易见光见热分解[22]，因此要加入还原剂盐酸羟胺溶液，防止目标物从提取液中分解出来；而且MG和LMG以离子形式存在于溶剂中，离子对试剂对-甲苯磺酸钠的加入是为了与目标物形成离子对，增加MG和LMG的稳定性，从而提高目标物的回收率[23]。同样，在2.1所确定的试验参数基础上，考查盐酸羟胺和对-甲苯磺酸钠溶液对目标物回收率的影响。主要进行如下 3个试验。

（1）不加盐酸羟胺和对-甲苯磺酸钠；

（2）加入1.5 mL 20%的盐酸羟胺溶液和2.5 mL 1.0 mol/L的对-甲苯磺酸钠溶液；

（3） 加入2 mL 20%的盐酸羟胺溶液和1 mL 1.0 mol/L的对-甲苯磺酸钠溶液。

盐酸羟胺和对-甲苯磺酸钠溶液添加量对回收率的影响见表2。

表2 盐酸羟胺和对-甲苯磺酸钠溶液添加量对回收率的影响/%

由表2可知，添加2 mL 20%的盐酸羟胺溶液和1 mL 1.0 mol/L的对-甲苯磺酸钠溶液是最佳试验条件。

2.3 富集净化方法对目标回收率的影响

通常，前处理中将目标物富集纯化的方法有旋蒸[24]、萃取上清液[18]和冷冻[25]等方法。试验步骤如下：

在2.2所确定的试验参数基础上，分别用以下3种方法对目标物进行富集和纯化。

（1）将反复提取得到的上清液，在45℃条件下旋转蒸发至近干，加入2 mL乙腈溶解残渣，超声3 min，静置，取上清液，并用乙腈定容至刻度，过0.45 μm滤膜，滤液供液相色谱测定。

（2）取2.5 mL的上清液，加入1.2 mL吸水试剂水硫酸钠，离心后取上清液，过0.45 μm滤膜，滤液供液相色谱测定。

（3）将反复提取得到的上清液在冰箱（-18℃）贮藏12 h，取未冻结的上清液，并用乙腈定容至一定刻度后过0.45 μm滤膜，滤液供液相色谱测定。

不同富集净化方法对目标物回收率的影响见表3。

由表3可知，方法1和方法2对目标物均有较好的回收效果，甚至方法2的回收率更高，这是由于方法2较方法1减少了旋蒸，从而减少了目标物的损失。同时还可以看出，方法2中LMG的回收率超过100%，这是由于一部分MG转化为LMG[23]，其原因有待进一步考证。考虑到方法2将原有样品中目标物的浓度稀释倍数太高，在实际测试中达不到痕量测试的要求，故优先选择方法1。

2.4 氯化钠对目标物回收率的影响

2.4.1 氯化钠属性对目标物回收率的影响

试验考查氯化钠添加量为0.1 g时对试验结果的影响。结果表明，MG回收率分别为88.63%和90.43%，LMG为85.77%和91.65%。这是由于氯化钠的加入使乙腈和水形成了双水相，水与乙腈临界层存在一种张力[27]，促使分子或者离子的MG和LMG更多地移向乙腈层。

2.4.2 氯化钠添加量对目标物回收率的影响

在2.3所述试验方法1的基础上，考查在提取过程氯化钠分别为0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0，2.2，2.4 g时MG和LMG回收率的影响。

氯化钠添加量对目标物回收率的影响见图3。

表3 不同富集净化方法对目标物回收率的影响/%

图3 氯化钠添加量对目标物回收率的影响

由图3可知，随着氯化钠添加量的增加，目标物的回收率越高，当氯化钠添加量为2 g时，目标物的回收率达到最高，MG和LMG分别为95.60%和101.2%；随着氯化钠添加量继续升高，目标物的回收率趋于平缓，甚至下降。这是由于乙腈经旋蒸出去后，鸡心瓶中剩下含有目标物的氯化钠溶液。向蒸发至近干的鸡心瓶中加入乙腈，在氯化钠离子的水化作用下，乙腈与水形成双水相，并使MG和LMG在乙腈层富集，从而大大提高了目标物的回收率；但过量添加氯化钠又会产生盐析作用，使目标物与乙腈间产生粒子斥力，导致回收率有所降低[28-29]。

2.5 乙酸胺溶液（用冰乙酸调节pH值至4.5）对试验结果的影响

试验还考查了不加乙酸胺溶液和加入2 mL的0.1 mol/L乙酸胺溶液（用冰乙酸调节pH值至4.5）对试验结果的影响，结果表明不加入乙酸胺溶液时，样品的曲线中MG的峰和旁边的杂质峰分不开，从而影响了试验对MG含量的测定，进一步影响了试验对各个影响因素的影响判定。

3 试验方法的最终确定

通过试验，水产品中MG、LMG残留量提取富集的方法最终优化如下：

在GB/T 19857—2005基础上，5 g左右样品在用乙腈-乙酸胺溶液提取时，需加入2 mL质量分数为20%的盐酸羟胺溶液，1 mL浓度为1.0 mol/L的对-甲苯磺酸钠溶液，2 mL的0.1 mol/L乙酸胺溶液（用冰乙酸调节pH值至4.5），8 g酸性氧化铝，2 g氯化钠。反复提取，合并上清液，旋蒸，用乙腈溶解残渣。超声时间5 min，静置，取上清液，并用乙腈定容至刻度，其含量用高效液相色谱-紫外检测器法进行检测。此方法得到的回收率最高，其中MG可达95.6%，LMG可达101.2%，且稳定性好。

4 讨论

（1）试验首次将氧化铝、还原剂、离子对试剂、无机盐和富集纯化方法等因素综合起来考察，并讨论研究了这些因素分别对目标物回收率的影响效果。

（2）试验建立了将双水相萃取技术与高效液相色谱-紫外检测器的方法结合用来提取、富集纯化水产品中孔雀石绿和隐形孔雀石绿残留的方法，该方法具有操作简单、净化效果好、回收率高、稳定性好、降低成本、适用于痕量分析和大批量处理等优点，适合在食品检测中推广使用。

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Optimization Method of Extracting Malachite Green and Leucomalachite Green Residues in Fishery Products

FAN Fangfang，*LI Xiao，WU Kun，LI Jing，SHI Xudong
（Shaanxi Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Xi'an，Shaanxi 710048，China）

On the basis ofGB/T 19857—2005，the aim of this research is to optimize the methods of extracting and concentrating LG and LMG from fishery products detecti by HPLC-UV.Some factors having effect on recovery rate have been studied，such as alumina，solution ofhydroxylamine hydrochloride，solution of p-toluene sulfonic acid，enrichment and purification methods，sodium chloride and buffer solution of ammonium acetate.The results of this investigation show that the specimen with about5 g have been extraced by acetonitrile on the condition when the dosage of solution of hydroxylamine hydrochloride is 2 mL，as well as solution of p-toluene sulfonic acid（1.0 mL/L）is 1 mL，buffer solution of ammonium acetate（20%）is 2 mL，acidic alumina should be 8 g and sodium chloride should be 2 g.The specimens have been successively separated and purified，while clear liquid in the upper level has been evaporated by rotating.It can be expected that the recovery would reach its peak value which MG is 95.6%as well as LMG is 101.2%.In addition，this is a high-recovery method which has simple pretreatment，and is applicable for quickly and accurate determination of large number of samples.

fishery products；malachite green；leucomalachite green；HPLC-UV；recovery

X52

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.056

1671-9646（2017）01b-0061-05

2016-12-13

范芳芳（1987— ），女，硕士，检验员，研究方向为食品质量安全。

*通讯作者：李 晓（1963— ），男，大专，工程师，研究方向为农副产品质量安全。