菱角多糖提取及抗氧化能力研究

董向东，孟秀梅，王晶晶，李明华

（1.江苏食品药品职业技术学院，江苏淮安 223003；2.江苏食品加工工程技术研究开发中心，江苏淮安 223003）

菱角多糖提取及抗氧化能力研究

董向东1，2，*孟秀梅1，2，王晶晶1，2，李明华1，2

（1.江苏食品药品职业技术学院，江苏淮安 223003；2.江苏食品加工工程技术研究开发中心，江苏淮安 223003）

以提取菱角淀粉后的离心液为原料，采用蛋白酶酶解的方法制备菱角多糖，通过单因素试验及正交试验进行提取条件优化。试验结果显示，蛋白酶添加量0.018%，酶解温度50℃，酶解时间2 h，酶解pH值5时，菱角多糖提取率12.65%，其中蛋白质残留率为1.08%，菱角多糖质量浓度1.5 mg/mL的羟基自由基清除率为56.8%。

菱角；多糖；酶法；提取

菱角，又名水栗、菱实，属被子植物门、双子叶植物纲、桃金娘目、菱科（Trapaceae），是一年生草本水生植物菱的果实，在我国已经有2 000多年的栽培历史[1]。李向红等人[2]对南方菱角的成分分析中得出其含蛋白质9%，脂肪5 mg/kg，糖20%，钙9 mg/kg，VA 0.1 mg/kg，VB12.3 mg/kg，VB20.5 mg/kg，VC 50 mg/kg，VPP 19 mg/kg，南方菱角具有较高的营养价值。

目前，对菱角的利用主要有2个方面，一是鲜食，二是加工。然而，目前我国的菱角加工产品大多为初级产品，其科技含量、产品档次、加工增值率都相对较低，市场竞争力弱。菱角多糖分别由阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖和蜜二糖组成，其中以葡萄糖、半乳糖、甘露糖和木糖为主[3-4]。以制备菱角淀粉离心的上清液为原料进行菱角多糖的制备，而菱角蛋白水溶性好，多为可溶性蛋白[5]。根据这一特性，采用蛋白酶酶解的方法对菱角淀粉离心液中的蛋白质进行酶解去除，制备纯度更好的菱角多糖，不但可以提高菱角的附加值，还可以实现菱角的综合利用。

1 材料与设备

1.1 材料

新鲜菱角，购自淮安城南菜市场；95%乙醇、醋酸、碳酸钠、蛋白酶（100 000 IU/g），均为食品级、市售；硫酸亚铁、水杨酸、双氧水、无水乙醇，均为分析纯。

1.2 主要设备与仪器

DZF-6050型真空干燥箱，上海捷呈试验仪器有限公司产品；JYL-C022型九阳料理机，九阳股份有限公司产品；RE-2000A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品；循环水真空泵，巩义市予华仪器有限公司产品；HH-2型数显恒温水浴锅，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司产品；BSA224S-CW型电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品；PHS-3CW型测定仪，上海理达仪器厂产品；DHP-9052型电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品。

2 试验方法

2.1 工艺流程

2.2 菱角多糖的制备

新鲜菱角去壳，获得菱角肉，按照菱角肉与纯净水1∶1的比例置于九阳料理机中进行磨浆，至浆液细腻均匀后，将其置于高速离心机中；以转速5 000 r/min离心20 min，离心后沉淀，经除杂后烘干制备菱角淀粉；将上清液采用蛋白酶进行酶解，将酶解液灭酶后置于旋转蒸发仪中进行浓缩，浓缩至离心液体积的1/5左右即可；将浓缩液倒入烧杯中，缓慢地向浓缩液中加入4倍浓缩液体积量的80%乙醇，加入的过程中要一边倒入乙醇，一边用玻璃棒不断地搅拌，加入乙醇的速度不能过快。待乙醇全部加入到浓缩液中，将其置于4℃冰箱中静置24 h[1]；取出后，用高速离心机以转速5 000 r/min离心10 min，收集沉淀；上清液回收乙醇重复利用，下层沉淀再加入95%乙醇清洗2～3次，然后置于真空干燥箱中进行干燥，即可得到菱角多糖。

2.3 单因素试验

2.3.1 蛋白酶添加量对菱角多糖提取的影响

准确称取一定量的菱角离心上清液，按照菱角肉量折算添加0.012%，0.015%，0.018%，0.021%，0.024%的蛋白酶；采用醋酸溶液调节酶解pH值至5，置于恒温水浴锅中50℃酶解1.5 h，酶解完毕后升温至85℃，并保温10 min进行灭酶；高速离心机进行离心，上清液进行真空浓缩，浓缩至原体积的1/5后加入4倍浓缩液体积量的80%乙醇；静置沉淀经95%乙醇洗涤后进行真空干燥，即得菱角多糖。

2.3.2 酶解温度对菱角多糖提取的影响

准确称取一定量的菱角离心上清液，按照菱角肉量折算添加0.018%的蛋白酶；采用醋酸溶液调节酶解pH值至5，置于恒温水浴锅中30，40，50，60，70℃酶解1.5 h。后续步骤同蛋白酶添加量处理方式。

2.3.3 酶解时间对菱角多糖提取的影响

准确称取一定量的菱角离心上清液，按照菱角肉量折算添加0.018%的蛋白酶；采用醋酸溶液调节酶解pH值至5，置于恒温水浴锅中50℃分别酶解0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h。后续步骤同蛋白酶添加量处理方式。

2.3.4 酶解pH值对菱角多糖提取的影响

准确称取一定量的菱角离心上清液，按照菱角肉量折算添加0.018%的蛋白酶；采用醋酸溶液调节酶解pH值至4，5，6，采用碳酸钠溶液调节酶解pH值至8，置于恒温水浴锅中在50℃下酶解1.5 h。后续步骤同蛋白酶添加量处理方式。

2.4 正交试验

在单因素试验的基础上，选择蛋白酶添加量、酶解温度、酶解时间及酶解pH值为考查因素，以菱角多糖提取率为指标，采用正交表L9（34）四因素三水平的试验。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

2.5 评定方法

2.5.1 菱角多糖提取率

2.5.2 蛋白质残留率

菱角多糖中蛋白质采用凯氏定氮法进行测定[6]。

2.5.3 羟自由基的清除率

利用H2O2与Fe2+混合产生羟基自由基在体系内加入水杨酸捕捉羟基自由基并产生有色物质，该物质于波长510 nm处有最大吸收。反应体系中含9.8 mmol/L H2O22 mL，9 mmol/L FeSO42 mL，9 mmol/L水杨酸-乙醇2 mL。不同质量浓度的菱角多糖溶液2 mL，最后加H2O2启动反应，于37℃条件下反应30 min，以超纯水为参比，测量各质量浓度的吸光度A样品。考虑到多糖本身的吸光度，以FeSO4，水杨酸-乙醇不同质量浓度的多糖溶液和纯水作为多糖的本底吸收；对照组用蒸馏水代替水杨酸，测定吸光度A本底，空白组用蒸馏水代替多糖，测定吸光度A空白，按照下式计算羟基自由基清除率[7]。

3 结果与分析

3.1 蛋白酶添加量对菱角多糖提取的影响

蛋白酶添加量对菱角多糖提取的影响见图1。

图1 蛋白酶添加量对菱角多糖提取的影响

由图1可知，随着蛋白酶添加量的增加，菱角多糖提取率呈现不断上升的趋势，蛋白质残留率呈现逐渐下降的趋势；当蛋白酶添加量超过0.018%时菱角多糖提取率升高趋势缓慢，蛋白质残留率降低也变缓慢。推测原因随着蛋白酶添加量的不断增加，使得整个体系中的可溶性大分子物质不断增加，使得加入乙醇沉淀后总的可溶性物质增加，蛋白质酶解率不断提高，考虑到蛋白酶的成本，选择0.015%，0.018%，0.021%带入正交试验优化。

3.2 酶解温度对菱角多糖提取的影响

酶解温度对菱角多糖提取的影响见图2。

图2 酶解温度对菱角多糖提取的影响

由图2可知，随着酶解温度的升高，菱角多糖提取率与蛋白质残留率呈现相反的趋势；当酶解温度为50℃时菱角多糖的提取率达到峰值，此时蛋白质残留率最少。推测原因为蛋白酶的最佳酶活温度为50℃左右，在此温度下蛋白质酶解程度较高，菱角离心上清液中的多糖也不会因为酶解温度的过高造成分解，导致菱角多糖提取率下降。因此，选择40，50，60℃进行正交试验。

3.3 酶解时间对菱角多糖提取的影响

酶解时间对菱角多糖提取的影响见图3。

图3 酶解时间对菱角多糖提取的影响

由图3可知，随着酶解时间的延长，菱角多糖提取率呈现先上升后下降的趋势；而蛋白质残留率呈现逐渐下降的趋势，这与酶和长时间热处理有关。蛋白酶酶解有助于菱角多糖的提取，但是随着长时间的热处理会引起多糖水解成小分子，从菱角多糖提取率及蛋白质残留率的变化，综合考虑后选择1.0，1.5，2.0 h进行正交试验。

3.4 酶解pH值对菱角多糖提取的影响

酶解pH值对菱角多糖提取的影响见图4。

图4 酶解pH值对菱角多糖提取的影响

3.5 正交优化试验

正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果

由表2可知，对菱角多糖提取率影响最大的为蛋白酶添加量，其次为酶解时间，酶解温度和酶解pH值对菱角多糖提取率影响较小，最佳的因子组合为A2B2C3D2，即蛋白酶添加量0.018%，酶解温度50℃，酶解时间2 h，酶解pH值5时，可获得较高的菱角多糖提取率。由于上述因素组合不在正交表中，进行验证试验，菱角多糖提取率为12.65%，其中蛋白质残留率为1.08%。

3.6 菱角多糖羟基自由基清除能力

菱角多糖羟基自由基清除能力见图5。

图5 菱角多糖羟基自由基清除能力

由图5可知，随着菱角多糖质量浓度的不断提高，羟基自由基清除率呈现逐渐上升的趋势。菱角多糖质量浓度为1.5 mg/mL时，羟基自由基清除率达到56.8%；再继续增加菱角多糖的质量浓度，羟基自由基清除率增长变缓；待菱角多糖质量浓度达到2.5 mg/mL时，羟基自由基清除率为69.7%。可见，菱角多糖具有较强的羟基自由基清除能力。

4 结论

采用蛋白酶酶解处理菱角上清液制备菱角多糖，并进行羟基自由基清除试验。结果显示，对菱角多糖提取率影响最大的为蛋白酶添加量，其次为酶解时间，酶解温度和酶解pH值对菱角多糖提取率影响较小，最佳的因子组合为蛋白酶添加量0.018%，酶解温度50℃，酶解时间2 h，酶解pH值5时，此时可获得12.65%菱角多糖，其中蛋白质残留率为1.08%。菱角多糖对羟基自由基具有较好的清除能力，并呈现一定的量效关系，菱角多糖质量浓度为1.5 mg/mL时，羟基自由基清除率达到56.8%。所制备菱角多糖中含有一定量的蛋白质，同时还含有一些其他水溶性成分，这些物质都会影响到其对羟基自由基的清除能力，需要进一步对其进行纯化，以获得更高纯度的菱角多糖。

[1]林健.菱角多糖口服液制剂的研究 [D].长春：吉林大学，2011.

[2]李向红，邓放明，刘展.菱资源开发利用现状与趋势[J].中国食物与营养，2004（8）：26-28.

[3]彭静，柯卫东，刘义满，等.菱角的营养成分及医药保健作用 [J].长江蔬菜，2009（16）：17-19.

[4]盛占武，孙志高，鄯晋晓.菱角的保健功能及其产品开发进展 [J].食品研究与开发，2006，27（9）：160-164.

[5]马萌，周惠明，朱科学，等.菱角中淀粉和蛋白的分离制备及性质研究 [J].食品工业科技，2013（9）：146-149，153.

[6]中华人民共和国卫生部.GB 5009.5—2010食品安全国家标准食品中蛋白质的测定 [S].北京：中国标准出版社，2010.

[7]刘志国，赵文亚.菱角壳粗多糖体外清除自由基活性的研究 [J].安徽农业科学，2012，40（22）：11 182-11 183，11 209.◇

Study on Polysaccharide Extraction from Water Chestnut

DONG Xiangdong1，2，*MENG Xiumei1，2，WANG Jingjing1，2，LI Minghua1，2，
（1.Jiangsu Food and Pharmaceutical Science College，Huaian，Jiangsu 223003，China；2.Jiangsu Engineering Research and Department Center for Food Processing，Huaian，Jiangsu 223003，China）

Polysachharide is obtained from water chestnut residue with the method of protease hydrolysis.According to single factor and orthogonal test，the optimal conditions are protease 0.018%，temperature 50℃，time 2 h，pH 5.0.Under this condition，the extraction rate of the polysaccharide is 12.56%.The protein residue rate of the polysaccharide is 1.08%.When the polysaccharide concentration is 1.5 mg/mL，the hydroxyl radical scavenging rate is 56.8%.

water chestnut；polysaccharide；enzymatic method；extraction

R284.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.038

1671-9646（2017）01b-0009-03

2016-12-28

江苏省高校大学生创新训练计划项目（201613104017X）。

董向东（1995— ），男，大专，研究方向为食品生物技术。

*通讯作者：孟秀梅（1980— ），女，硕士，副研究员，研究方向为食品生物技术。