发酵乳中氨基甲酸乙酯的测定

袁小美，金 尉，陈 娟

（1.苏州出入境检验检疫局，江苏苏州 215104；2.苏州世标检测技术有限公司，江苏苏州 215104）

发酵乳中氨基甲酸乙酯的测定

袁小美1，2，金 尉1，2，陈 娟1，2

（1.苏州出入境检验检疫局，江苏苏州 215104；2.苏州世标检测技术有限公司，江苏苏州 215104）

建立发酵乳中氨基甲酸乙酯含量测定的气相色谱质谱方法。发酵乳样品除蛋白后，取清液进行硅藻土柱富集净化，二氯甲烷洗脱，气相色谱-质谱仪选择离子模式测定。为保证回收率，以氨基甲酸乙酯-D5为内标。氨基甲酸乙酯在10～500 μg/L范围内线性关系良好，相关系数R2=0.999 9。按信噪比3∶1确定检出限为2 μg/kg，信噪比10∶1确定定量限为5 μg/kg。回收率在85%～109%，RSD＜8.7。此方法可应用于发酵乳中氨基甲酸乙酯的测定。

氨基甲酸乙酯；硅藻土柱；内标法；气相色谱质谱法；发酵乳

发酵食品在加工与储存过程中产生大量的氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）前体，如氢氰酸、尿素、瓜氨酸等，这些前体在一定条件下与发酵产生的乙醇发生反应生成EC。EC是一种水溶性致癌物质，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病[1]。美国、加拿大、日本等国都对其最高允许含量做了限制[2]。例如，加拿大1985年设定了各类酒中的限量标准，其中佐餐葡萄酒中EC含量不得超过30 μg/L，美国食品和药品管理局（USFDA）规定1988年以后生产的佐餐葡萄酒（酒精度≤14%）中EC含量不能超过15 μg/L，日本清酒规定其含量不得超过100 μg/L[3]。在我国，EC已成为目前国内食品安全重要监测项目之一，但仍没有相关限量法规出台。但目前我国建立了酒和酱油中EC的检测方法，发酵乳中EC含量虽然不高[4]，但作为常见的发酵产品，在日常生活中接触很多，存在一定的风险，因此有必要对其进行监控。试验在前人研究的基础上[1-6]，对发酵乳中EC的分析方法进行验证和优化，建立简单、有效的发酵乳中EC的测定。

1 设备与材料

1.1 主要试剂

正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈，均为色谱纯，Fisher公司提供；盐酸、氯化钠、无水硫酸钠，均为分析纯，国药试剂公司提供。

氨基甲酸乙酯（EC），纯度98.5%；氨基甲酸乙酯-D5（EC-D5）标准品，纯度99%；Dr.Ehrenstorfer GmbH。

硅藻土柱：AgilentChemElut5mL，P/N:12198006。

1.2 设备

Agilent GC-MS 7890N5975C型气相色谱-质谱联用仪、电子轰击源（EI）、H2050R型高速离心机、N-EVAP型氮吹仪、涡旋混合仪、AE100型电子天平、Milli-Q型超纯水器等。

1.3 标准溶液配制

分别称取标准品和内标0.01 g（精确到0.1 mg）至10mL容量瓶中，乙腈溶解，定容，配制成1000mg/L的标准储备溶液，于4℃下避光保存。再分别移取100 μL至10 mL容量瓶中，乙腈定容，配制成10 mg/L的标准工作液，于4℃下避光保存。标准曲线用乙酸乙酯配制，氨基甲酸乙酯质量浓度为10，50，100，200，500 μg/L，或根据需要配制；内标质量浓度为100 μg/L。

2 分析步骤

2.1 样品前处理

移取样品20 g，加入适量内标，2 mol/L盐酸调节pH值为2左右沉淀蛋白，离心取上清液，沉淀中加入8 mL水，振摇提取，离心后合并上清液，定容至20 mL，取5 mL备用。

2.2 净化

备用液加入硅藻土柱，静置吸附10 min。20 mL正己烷淋洗，弃去淋洗液，二氯甲烷洗脱，收集洗脱液20 mL。洗脱液经无水硫酸钠除水后氮吹至近干，加入1 mL乙酸乙酯，过膜后进行气相色谱质谱检测。

2.3 色谱条件

AgilentVF-WAXms型色谱柱，0.25mm×0.25μm× 30 m；色谱柱温度：于60℃下保持1 min，以5℃/min升至150℃，以25℃/min升到230℃，在230℃下运行5 min；载气：氮气，1.0 mL/min；进样量：1 L；进样方式：不分流进样。

2.4 质谱条件

进样口温度220℃，接口温度240℃，离子源温度230℃，溶剂延迟14 min；检测方式选择离子监测模式。

3 分析与讨论

3.1 前处理条件的优化

仅采用溶剂提取会导致基质效应明显，且检出限相应较高，而乳制品中氨基甲酸乙酯本身含量不是很高，不利于方法的实际应用。因此，采用固相萃取方法进行处理。

分别比较乙酸乙酯、乙醚、5%乙酸乙酯-乙醚溶液、二氯甲烷[1]、10%甲醇-二氯甲烷溶液洗脱效果，20 mL二氯甲烷洗脱效果最好。

上样后待测液自然渗入硅藻土柱，待测液和洗脱液均依靠重力作用从硅藻土柱中流出。结果表明，EC能得到很好保留，淋洗和洗脱后可以得到较好的回收效果。

发酵液体乳制品蛋白含量高，试验中发现若直接离心后进行固相萃取净化容易出现堵塞，影响方法稳定性。因此，采用稀酸调节pH值沉淀蛋白质，离心后取清液再进行固相萃取净化。

3.2 内标物的选择

发酵乳含有大量的蛋白质、脂肪、碳水化合物、酸等杂质，基质黏稠、干扰多，仅用外标法很难达到回收率的要求，且回收率稳定性也比较差。同位素内标稀释法越来越多的用在微量化合物的检测，可以对样品中待测物含量进行有效的校正，提供更好的检测灵敏度和稳定性[4]。考虑到内标物与目标化合物性质越相近越好，该方法采用氨基甲酸乙酯-D5作为内标，价格也可以接受。

3.3 色谱条件的优化

根据质谱定性检测要求、离子强度、样品测定抗干扰性，分别选择62 m/z，64 m/z作为EC和ECD5的定量离子，74 m/z，89 m/z作为EC的定性离子，76 m/z，94 m/z为EC-D5的定性离子。采用基质匹配溶液配制标准曲线。

EC和EC-D5定量及定性选择离子见表1，EC和EC-D5标准物质的选择离子色谱图见图1，EC标准品的选择离子质谱图（62，74，89 m/z）见图2，EC-D5标准品的选择离子质谱图（64，76，94 m/z）见图3。

表1 EC和EC-D5定量及定性选择离子

3.4 方法检出限和回收率

根据样液中被测物的含量情况，选定质量浓度与样液相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中氨基甲酸乙酯的响应值，均应在仪器检测线性范围内。在阴性基质中进行加标试验，按信噪比3∶1确定检出限，信噪比10∶1确定定量限。确定发酵乳中检出限为2 μg/kg，定量限为5 μg/kg。氨基甲酸乙酯在10～500 μg/L范围内线性关系良好，相关系数R2=0.999 9，线性方程式为Y=1.088X-0.014 11。

为验证方法的稳定性和准确性，分别进行定量限、2倍定量限和10倍定量限加标回收试验，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。结果表明，发酵乳中EC的回收率在85%～109%，RSD＜8.7%。

发酵乳样品中EC加标回收率及RSD（n=6）见表2。

4 结论

采用内标法测定发酵乳中氨基甲酸乙酯含量，该方法简单、有效、稳定，检测灵敏度高，回收率好。试验对现有检测方法进行了优化，能够满足日常检测需求。

图1 EC和EC-D5标准物质的选择离子色谱图

图2 EC标准品的选择离子质谱图（62，74，89 m/z）

图3 EC-D5标准品的选择离子质谱图（64，76，94 m/z）

表2 发酵乳样品中EC加标回收率及RSD（n=6）

[1]谭波涛，郝媛媛，赵杰，等.GC-MS法测定发酵食品中氨基甲酸乙酯的含量 [J].分析实验室，2011，30（12）：31-33.

[2]朱志鑫，吴惠勤，黄晓兰，等.发酵食品中氨基甲酸乙酯的分析方法 [J].食品科技，2009，34（6）：287-290.

[3]李凤华，曹艳平，王锡宁.GC-MS法测定酒中的氨基甲酸乙酯 [J].中国卫生检验杂志，2009，19（6）：1 240-1 241.

[4]李杰，于瑞祥，许卓妮，等.同位素稀释-气相色谱-质谱法测定发酵乳中氨基甲酸乙酯 [J].质谱学报，2015，36（3）：268-273.

[5]石维妮，刘晓毅，赵玉琪，等.发酵性食品中的氨基甲酸乙酯含量调研 [J].中国酿造，2009（11）：124-126.

[6]严成.南瓜双歧发酵乳的工艺研究 [J].西南科技大学学报，2003（4）：65-68.◇

Determination of Ethyl Carbamate Residues in Fermented Milk

YUAN Xiaomei1，2，JIN Wei1，2，CHEN Juan1，2
（1.Suzhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Suzhou，Jiangsu 215104，China；2.Suzhou World Standard Testing Technology Co.，Ltd，Suzhou，Jiangsu 215104，China）

A method for determination of ethyl carbamate residues in fermented food by GC-MS is developed.By means of diatomaceous earth column，ethyl carbamate is enriched and purified.The target substance is eluted by dichloromethane.The identification is performed by GC-MS in selected ion monitoring（SIM） mode.Ethyl carbamate-D5 is used as internal standard.Good linear at 10～500 μg/L，the correlation coefficient R2=0.999 9.The limit of determination is 2 μg/kg，the limit of quantitation is 5 μg/kg.The recovery rate is 85%～109%，RSD＜8.7.This method can be applied to the detection of EC in fermented food.

ethyl carbamate；diatomaceous earth column；internal standard method；GC-MS；fermented milk

TQ225

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.053

1671-9646（2017）01b-0053-03

2016-12-10

袁小美（1990— ），女，本科，检验员，研究方向为食品检验。