一株从青海酸奶中分离出来的嗜酸乳杆菌的分离鉴定与特性研究

张雅茹，薛 莉，左志刚，张 进，马征途

（内蒙古双奇药业股份有限公司，内蒙古呼和浩特 010010）

一株从青海酸奶中分离出来的嗜酸乳杆菌的分离鉴定与特性研究

张雅茹，薛 莉，左志刚，张 进，*马征途

（内蒙古双奇药业股份有限公司，内蒙古呼和浩特 010010）

从青海酸奶中分离鉴定出嗜酸乳杆菌，并对其进行降血脂的研究。结合细菌形态学和16S rDNA序列同源性分析进行鉴定，并通过检测总胆固醇和甘油三酯的含量来确定嗜酸乳杆菌降血脂的能力。结果表明，从青海酸奶中分离出的菌株为嗜酸乳杆菌，其能降低小鼠血清中的胆固醇，可见嗜酸乳杆菌具有降血脂的功能。

嗜酸乳杆菌；分离鉴定；降血脂

嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus） 属于乳杆菌属，是人体肠道内的重要微生物，与人体健康息息相关，当其达到一定数量时，对维护肠道健康和菌群平衡起着十分重要的作用，是目前乳酸菌家族中重点研究与开发的益生菌之一，被视为第3代酸乳发酵剂菌种[1-2]。嗜酸乳杆菌在肠道内发酵后，可产生乳酸和醋酸，能提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和VD的吸收，产生VK及VB，还可以减少胆固醇的吸收，并能降低辐射对人体的伤害，已被广泛用于发酵食品与微生态制剂[3]。

随着国内外众多学者对嗜酸乳杆菌的生物学特性、功能性及应用等方面研究的不断深入，人们越来越认识到嗜酸乳杆菌的益生特性，含有嗜酸乳杆菌的产品也日益丰富，包括酸奶、胶囊、片剂、粉剂及口服液等[4]。试验通过对青海酸奶分离的嗜酸乳杆菌进行分离鉴定，并对其降血脂的特性进行了研究，为开发降血脂产品奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

青海酸奶。

1.1.2 培养基

MRS液体培养基、MRS固体培养基。

1.1.3 主要试剂

PCR引物，上海桑尼生物科技有限公司提供；10×PCR buffer、dNTP、rTaq酶，大连宝生物有限公司提供；PCR试剂盒、胶回收试剂盒等，Invitrogen公司提供；高脂饲料包括78.8%基础饲料、1%胆固醇、10%蛋黄粉、10%猪油、0.2%胆盐。

先熬猪油，再将胆固醇溶解，最后加胆盐，但要掌握火候，胆盐高温易变硬。混匀后直接倒入饲料中，拌匀后进行烹炒，使油脂浸透。

1.1.4 试验动物

健康清洁级昆明小鼠，由内蒙古大学动物中心提供。

1.1.5 血脂指标检测

贝克曼库尔特AU5800型全自动生化分析仪。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离纯化

将青海酸奶用生理盐水做系列稀释，涂布于MRS固体培养基，于37℃条件下厌氧培养36 h，挑取单菌落，反复划线分离至获得纯菌株。对菌落形态进行观察，并进行革兰氏染色。

1.2.2 糖发酵结果

试验项目包括苦杏仁苷、阿拉伯糖、纤维二糖、七叶苷、果糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖酸盐、乳糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、松三糖、蜜二糖、鼠李糖、核糖、水杨苷、山梨醇、白砂糖、海藻糖和木糖发酵试验，发酵结果与《伯杰细菌鉴定手册》进行比对[5]。

1.2.3 16S rDNA序列分析与分子鉴定

将纯化好的菌株接种于10 mL无菌MRS液体培养基中，于37℃条件下培养24 h，连续培养3代后采用CTAB法提取其总DNA[6]，并利用细菌通用引物PCR扩增其16S rDNA片段[7]。上游引物序列为：5'-CAGA GTTT GATC CTGG CT-3'；下游引物序列为5'-AGGA GGTG ATCC AGCC GCA-3'。PCR反应体系（25 μL），其中包括：上下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），模板DNA0.5 μL，5×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP.1 μL，加超纯水至25 μL，rTaq酶0.3 μL。PCR扩增程序：98℃，3 min；98℃，25 s；55℃，25 s；72℃，1 min；30个循环，72℃，10 min；4℃保温。将PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳检测片段长度约1 500 bp后的阳性产物直接送至上海桑尼生物技术有限公司进行序列测定，得到的序列运用软件校准排齐后，在GenBank数据库中进行Blast同源性比对分析，将待测菌株鉴定到种。

1.2.4 小鼠血清血脂的变化

将昆明雄性小鼠随机分成4组，每组20只，分别为空白对照组、模型对照组、嗜酸乳杆菌高剂量组（1.0×109CFU/只）、嗜酸乳杆菌低剂量组（1.0× 107CFU/只）4个组。空白对照组用基础饲料喂养，其余3组喂高脂饲料，定时定量给食及饮水，自由摄取，喂养15 d，待高脂模型建立后，每组随机取10只小鼠，测体重后对眼球采血，采血后尽快分离血清，测定总胆固醇和甘油三酯。模型建立后，空白对照组继续给予基础饲料，模型对照组及试验组继续给予高脂饲料。空白对照组每天灌胃生理盐水2 mL/只；模型对照组每天灌胃生理盐水2 mL/只；试验组每天分别灌胃嗜酸乳杆菌1.0×109CFU/只和1.0×107CFU/只，并定期称量体重，待15 d给药结束后，对每组剩余10只小鼠进行眼球取血，测定总胆固醇和甘油三酯。

2 结果

2.1 菌体镜检结果

显微镜下嗜酸乳杆菌的形态见图1。

图1 显微镜下嗜酸乳杆菌的形态

由图1可知，革兰氏染色为阳性，两端钝圆、中等大小、无芽胞、不运动的杆菌，以单个、成双或短链状出现。

2.2 糖发酵结果

嗜酸乳杆菌糖发酵鉴定结果见表1。

表1 嗜酸乳杆菌糖发酵鉴定结果

由表1可知，该细菌发酵苦杏仁苷、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、甘露糖、核糖、水杨苷和蔗糖，不发酵阿拉伯糖、纤维二糖、七叶苷、葡萄糖酸盐、甘露醇、松三糖、蜜二糖、棉籽糖、鼠李糖、山梨醇和木糖，符合《伯杰细菌鉴定手册》对嗜酸乳杆菌特点的描述，初步鉴定为嗜酸乳杆菌。

2.3 核酸鉴定结果

16S rDNA基因目的片段和PCR产物见图2。

用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，由图2可以观察到在1 500 bp左右处有一明亮的特征条带，表面扩增16S rDNA成功。

嗜酸乳杆菌16S rDNA测序见图3。

经过与GenBank中已发表菌株的标准序列进行同源性比较，此菌株与嗜酸乳杆菌的同源性为99.3%。

2.4 嗜酸乳杆菌对高脂小鼠的影响

2.4.1 嗜酸乳杆菌对高脂小鼠体重的影响

图2 16S rDNA基因目的片段和PCR产物

图3 嗜酸乳杆菌16S rDNA测序

嗜酸乳杆菌对小鼠体重的影响见图4。

图4 嗜酸乳杆菌对小鼠体重的影响

由图4可知，试验初期各高脂组小鼠的初始体重与空白组有显著差异，但3个高脂组间无差异。试验末各组小鼠的体重均有增加，其中模型对照组的体重增加最多为13.5 g，样品低剂量组和高剂量组的体重增加分别为10.1 g和9.2 g，空白对照组增加8.2 g。通过体重可以看出，高脂饲料会导致小鼠体重显著增加，样品组间无显著差异，但与模型对照组间有差异，说明嗜酸乳杆菌可以控制高血脂小鼠的体重。

2.4.2 嗜酸乳杆菌对高脂小鼠总胆固醇的影响

大豆卵磷脂对高脂小鼠血清胆固醇含量的影响见图5。

由图5可知，试验前模型对照组与样品组无显著差异，但3组的总胆固醇含量均高于空白对照组。试验末模型组的总胆固醇最高为2.96 mmol/L，高剂量组和低剂量组的总胆固醇分别为2.70 mmol/L和2.58mmol/L，空白对照组的总胆固醇为2.57 mmol/L。说明嗜酸乳杆菌可以降低血液中总胆固醇的含量，且呈现一定数量关系。

2.4.3 嗜酸乳杆菌对高脂小鼠甘油三酯的影响

大豆卵磷脂对血清甘油三酯含量的影响见图6。

图5 大豆卵磷脂对高脂小鼠血清胆固醇含量的影响

图6 大豆卵磷脂对血清甘油三酯含量的影响

由图6可知，试验前模型组与样品组无显著差异，但3组的甘油三酯含量均高于空白对照组。试验末模型对照组的甘油三酯含量最高为1.87 mmol/L，高剂量组和低剂量组的甘油三酯含量分别为1.39 mmol/L和1.26 mmol/L，空白对照组的甘油三酯为1.06 mmol/L。说明嗜酸乳杆菌可以降低血液中甘油三酯的含量。

3 讨论

（1）从青海酸奶中分离出来的菌经过16S rDNA鉴定为嗜酸乳杆菌。

（2）嗜酸乳杆菌能降低高血脂昆明小鼠血液中总胆固醇和甘油三酯的含量。

2014年8月8日，《中国心血管病报告2013》显示，心血管病死亡占城乡居民总死亡原因的首位，而这些心血管疾病绝大多数是由高血脂导致的动脉硬化而引起。在血脂异常人群中，据2010年全国调查发现，血清总胆固醇≥6.22 mmol/L的患病率分别占18岁以上男性、女性的3.4%和3.2%，血清甘油三酯≥2.26 mmol/L的男女患病率分别为13.8%和8.6%。中国心血管病危险因素流行趋势明显，导致心血管病的发病人数持续增加，而今后10年心血管病患病人数仍将快速增长。目前，市面上治疗脑血管疾病的药物大多有副作用，如硝酸酯是治疗脑血管疾病的一种常用药物，但是长期服用就会导致身体内部的调节机制紊乱，使血管收缩，药物的疗效降低。因此，开发一种对人体无副作用的降脂保健品必将有广阔的市场。

[1]FullerR.Peobioticsinhumanmedicine[J].Gut，1991（32）：439-442.

[2]赵瑞香.嗜酸乳杆菌及其应用研究 [M].北京：科学出版社，2007：22-29.

[3]奚灏锵，袁根良，杜冰，等.嗜酸乳杆菌发酵培养工艺研究 [J].广东饲料，2009，18（8）：20-22.

[4]范兴艺.嗜酸乳杆菌的分离、鉴定及其在发酵豆乳中生长特性的研究 [D].杭州：浙江工商大学，2008.

[5]布坎南R E，吉本斯N E.伯杰细菌鉴定手册 [M].北京：科学出版社，1984：802．

[6]F·奥斯伯，R·布伦特．精编分子生物学实验指南 [M]．颜子颖，王海林，译．北京：科学出版社，1998：37-39．

[7]Mauro S，Diego M，Silvia C，et al．Development of genus species specific PCR analysis for identification of carno bacterium strains[J]．Curr Microbiol，2002，45（1）：24-29.◇

Isolation and Identification and Characteristic Study of one Lactobacillus Acidophilus in Yogurt from Qinghai

ZHANG Yaru，XUE Li，ZUO Zhigang，ZHANG Jin，*MA Zhengtu
（Inner Mongolia Shuangqi Pharmaceutical Co.，Ltd.，Huhhot，Inner Mongolia 010010，China）

To isolate one kind of Lactobacillus acidophilus in yogurt from Qinghai and investigate its hypolipidemic action. Bacterial identification is performed on the basis of bacterial morphology and 16S rDNA sequence homology analysis，and the hypolipidemic action is researched by determining Lactobacillus acidophilus reducing the content of total cholesterol and triglycerides.The results show that the bacterium is Lactobacillus acidophilus，which can reduce content of total cholesterol and triglycerides.Lactobacillus acidophilus is characterized by reducing blood fat.

Lactobacillus acidophilus；isolationd and identification；hypolipidemic action

Q93.34

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.050

1671-9646（2017）01b-0044-03

2016-11-14

张雅茹（1976— ），女，本科，中级化工制药，研究方向为微生态制剂。

*通讯作者：马征途（1980— ），男，在读硕士，中级化工制药，研究方向为微生态制剂。