反相高效液相色谱法测定药材腊梅花中芦丁含量

黄 玮，肖新月，吴秀清，姚强文

(1．四川省资阳市食品药品检验检测中心，四川 资阳 641399； 2．中国食品药品检定研究院，北京 100003；3．四川金辉药业有限公司，四川 资阳 641300）

·检验检测·

反相高效液相色谱法测定药材腊梅花中芦丁含量

黄 玮1，肖新月2，吴秀清2，姚强文3

(1．四川省资阳市食品药品检验检测中心，四川 资阳 641399； 2．中国食品药品检定研究院，北京 100003；3．四川金辉药业有限公司，四川 资阳 641300）

目的建立测定药材腊梅花中芦丁含量的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法。方法色谱柱采用AgilentC18柱（250mm×4．6mm，5 m），以甲醇-0．05%磷酸水溶液（35∶65）为流动相，流速为0．8 mL／min，柱温为30℃。结果以芦丁峰面积的常用对数(Y)对进样量的常用对数（X）进行线性回归，得回归方程 Y＝1 643 977．49X+34 610．54，线性范围为0．005 19～1．557 0 g（r2＝1．00），加样回收率为98．91%，RSD为1．55%（n＝6）。结论该方法简便、准确，重复性好，可用于腊梅花的质量控制。

芦丁；腊梅花；反相高效液相色谱法

腊梅为腊梅科（Calycanthaceae）腊梅属植物腊梅Chimonanthus praecox(L．)Link．、素心腊梅 Chimonanthus praecox（L．）Link var．concolor Makino、红心腊梅 Chimonanthus praecox（L．）Link var．grandiflorus Rehd．vtW ils、狗爪腊梅 Chimonanthus praecox（L．）Link var．typicus Makino的干燥花蕾[1]。腊梅属于落叶灌木，冬腊月开花，有浓香[2]，始见于《本草纲目》中“与梅同时，色似蜜蜡”，《贵阳民间药草》又称“腊梅花作茶饮治久咳”，是我国特有的传统观赏花木，具有较高的观赏价值和经济价值[3]，且药用价值不可小觑。文献多采用紫外分光光度法进行总黄酮的含量测定[4]。本研究中参考文献[5-9]，采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定腊梅花中芦丁的含量，重复性好，现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

LC2010A型高效液相色谱仪（日本岛津公司），包括SPD-10AVP型紫外检测器，CBM-102型工作站；MS205DU型精密电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-100B型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1．2 试药

芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号为10080-201409，纯度为91．9%）。色谱用甲醇（TEDIA）、甲醇（分析纯）、磷酸（分析纯）、灭菌注射用水（四川科伦药业股份有限公司）。腊梅来源为四川省万源市青龙沟野生腊梅基地，经资阳市食品药品检验检测中心主任中药师吴秀清鉴定为素心腊梅 Chimonanthus praecox（L．）Link var．concolorMakino[10]。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：AgilentC18柱（250mm×4．6mm，5μm）；流动相：甲醇-0．05%磷酸水溶液（35∶65）；流速：0．8m L／min；检测波长：358 nm；柱温：30℃；进样量：10μL。在此色谱条件下的色谱图见图1。

2．2 溶液制备

对照品溶液：称取芦丁对照品10．22 mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加甲醇定容，制成每1mL含0．102 2mg的溶液，即得。

供试品溶液：取本品粗粉约0．25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25m L，称定质量，超声处理（功率250W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，即得。

图1 高效液相色谱图

空白溶液：置具塞锥形瓶中精密加入甲醇25 mL，取滤液即得。

2．3 方法学考察

测定波长选择：黄酮类采用多溶性甲醇或乙醇，本研究中采用甲醇作为溶剂，在280～430 nm波长扫描光谱。结果于358 nm波长处有最大吸收，故选择358 nm为测定波长。详见图2。

图2 波长扫描光谱图

提取方法考察：取本品粉末约0．2 g，共6份，精密称定，精密加入甲醇25 m L，称定质量，分别超声提取10，20，30min，或回流提取30，60，90min，放冷，补足减失的质量。过滤，取续滤液，即得。试验结果表明，采用超声处理30min与加热回流2 h峰面积相差不大，故采用超声提取30min。

线性关系考察：称取芦丁对照品10．38mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为0．103 8 g／L的对照品溶液，分别取0．5，1．0，2．0，5．0，10．0，20．0μL注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标、芦丁含量（X，μg）为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y＝1 643 977．49X+34 610．54，r2＝1．00(n＝6)。结果见表1。结果表明，芦丁进样量在0．005 19～1．557 0μg与峰面积线性关系良好。

表1 芦丁线性关系考察结果

精密度试验：精密量取对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，平行测定5次，记录峰面积。结果峰面积分别为 853 297，856 104，851 317，845 847，848 846，平均 851 082．2，RSD为 0．46%（n＝5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，于0，2，4，6，8，12，16，20，24 h时注入液相色谱仪测定。结果峰面积分别为574 496，579 119，565 172，575 832，578 786，581 209，583 082，582 088，584 477，平均为 578183．2，RSD为0．96%（n＝9），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：精密称取本品(L1)0．25 g，共6份，按拟定方法进样测定，记录色谱图，并计算含量。结果芦丁含量分别为2．333 4，2．330 6，2．330 6，2．288 2，2．310 6，2．370 1 mg／g，平均为 2．327 3 mg／g，RSD为 1．17%（n＝6），表明方法的重复性良好。

加样回收试验：精密量取对照品9．11mg加甲醇稀释至200mL容量瓶中，配成质量浓度为0．045 55 g／L的对照品溶液。同时，精密称取6份同一样品（L1）0．125 g，分别置100mL具塞锥形瓶中，精密加入配好的对照品溶液25 m L，精密称定。照拟订方法进行供试品溶液制备和测定，记录色谱图，并计算回收率。结果见表2。

2．4 样品含量测定

取药店、卫生院等购置样品10批，照拟订方法测定含量。结果10批含量平均值为2．373 mg／g，详见表3。测定结果表明，不同变种、不同批次腊梅花中芦丁含量波动范围不大。

表2 芦丁加样回收试验结果(n＝6)

表3 样品含量测定结果(n＝6)

3 讨论

3．1 流动相选择

考察流动相甲醇-0．3%磷酸溶液（35∶65），峰形对称，理论板数高，分离度符合要求，但磷酸酸性太强，对色谱柱损耗太大，改用甲醇-0．05%磷酸溶液（35∶65），峰形无明显变化，曾考察甲醇-水（40∶60），峰形有拖尾，因此选择甲醇-0．05%磷酸溶液（35∶65）作为测定流动相。

3．2 提取溶剂选择

取本品粉末约0．2 g，共4份，精密称定，分别精密加入50%甲醇、甲醇、乙醇10m L，称定质量，超声处理10 min，放冷，再称定质量，分别用溶剂补足减失的质量，滤过，取续滤液，用微孔滤膜（0．45μm）滤过。分别进样10μL，按拟订色谱条件进样测定。结果表明，50%甲醇有拖尾，乙醇有肩峰；采用甲醇作溶剂时，芦丁的提取效率最高，峰形较好。因此，选择甲醇为提取溶剂。

3．3 黄酮类化合物

腊梅花中含多种挥发油、生物碱及黄酮等化合物，主要含黄酮类化合物。现代研究证明，天然黄酮类化合物是植物体多酚类的内信号分子及中间体或代谢物，是重要的氧化剂和自由基消除剂，具有显著的生理药理活性。其能降低血管的脆性，改善血管的通透性，调节血脂和胆固醇，防治老年高血压和脑溢血，在护肝，解肝毒，抗真菌，治疗急、慢性肝炎，抗肝硬化等疾病临床都有应用[10-14]。

3．4 不足

本试验中通过反相高效液相色谱方法对腊梅花的化学成分进行分离鉴定，操作简便、快捷、准确，为腊梅花的药效物质基础及质量控制提供参考。本研究中仅对腊梅花中素心腊梅黄酮类成分里的一种物质进行了初步研究，故存在一定不足。以后的研究中，应涉及腊梅花药材的多个品种及不同变种，并进一步扩大研究范围。

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Content Determ ination of M edicinal Flowers Rutin Chimonanthus by RP-HPLC

Huang Wei1,Xiao Xinyue2,Wu Xiuqing2,Yao Qiangwen3
(1．Ziyang Food and Drug Inspection and Testing Center,Ziyang,Sichuan,China 641399; 2．China Food and Drug Administration Research Institute, Beijing,China 100003; 3．Sichuan Jinhui Pharmaceutical Co．,Ltd．,Ziyang,Sichuan,China 641300)

Ob jective To establish an RP-HPLC method for the content determination of medicinal flowers Lamei Rutin．M ethods Agilent C18column(250 mm×4．6 mm,5μm)was used,the column temperature was 30℃,Methanol-0．05% phosphoric acid aqueous solution (35∶65),the flow rate was 0．8 mL／min．Results In the selected chromatographic conditions,the peak area of the common logarithm(Y) of the commonly used sample size to number of(X)for linear regression,the regression equation was Y＝1 643 977．49X+34 610．54,the linear range was 0．005 19-1．557 0μg(r2＝1．00),the recovery rate was 98．91%,RSD was 1．55%(n＝6)．Conclusion This method is simple,accurate,reproducible,which can be used for the quality control of Rutin Chimonanthus flowers．

Rutin;chimonanthus flowers;RP-HPLC

R284.1；R282.71

A

1006-4931(2017)03-0030-03

2016-11-07)

10．3969／j．issn．1006-4931．2017．03．010

黄玮（1982-），大学本科，主管中药师，研究方向为中药鉴定、中成药检验及质量标准，（电子信箱）37752458＠qq．com。