蜡样芽孢杆菌分型方法研究进展

曹飞扬，王 娉，江连洲，陈 颖,*

（1.中国检验检疫科学研究院农产品安全研究中心，北京 100176；2.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

蜡样芽孢杆菌分型方法研究进展

曹飞扬1,2，王 娉1，江连洲2，陈 颖1,*

（1.中国检验检疫科学研究院农产品安全研究中心，北京 100176；2.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

蜡样芽孢杆菌是一种食源性条件致病菌，在环境和食品中分布比较广泛， 所引起的食物中毒常分为腹泻型和呕吐型。研究蜡样芽孢杆 菌的分型方法对该菌的预防、预警、溯 源及分子流行病学的调查都具有重要意义。目前，蜡样芽孢杆菌的分型方法主要包括噬菌体分型、生化分型等传统分型方法以及多位点序列分型、重复序列聚合酶链式反应分型、随机扩增多态性DNA分型、脉冲场凝胶电泳分型等分子分型方法。以蜡样芽孢杆菌为对象，综述其分型方法的研究进展，以期为该菌的分型提供一定参考。

蜡样芽孢杆菌；传统分型；分子分型

曹飞扬, 王娉, 江连洲, 等. 蜡样芽孢杆菌分型方法研究进展[J]. 食品科学, 2017, 38(17): 286-290. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201717046. http://www.spkx.net.cn

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蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是革兰氏阳性菌，兼性需氧，隶属于芽孢杆菌属。B. cereus呈长杆状，大小为（1.0～1.2） μm×（3.0～5.0 ）μm，产圆形或椭圆形的芽孢。在普通培养基上可生长成直径为3～8 mm的白色菌落，该菌落为圆形或近似圆形、稍有光泽、质地较软；在甘露醇卵黄多黏菌素（mannitol-egg-yolkpolymyxin，MYP）琼脂上呈现微粉红色菌落，周围有白色至淡粉红色沉淀环[1]。B. cereus的生化特点是不发酵甘露糖、阿拉伯糖、木糖，厌氧条件下可以发酵葡萄糖，通常能把明胶液化，产酪蛋白酶、卵磷脂酶、青霉素酶和过氧化氢酶。B. cereus能合成青霉素酶，对青霉素有很强的抗性，且该菌有很强的耐热性，它游离的芽孢在100 ℃条件下至少30 min才能被杀死。据相关报道，乳制品中还存 在一些耐低温的B. cereus，在冷藏温度甚至更低温度条件下仍然可以生长繁殖，引起食物中毒[2]。

B. cereus在水、空气、土壤中广泛存在，因此，食品很容易受到该菌的污染，几乎所有种类的食品都曾检出过蜡样芽孢杆菌，例如各种类型的乳制品、粮食、肉制品、海产品及蔬菜水果等[3-4]。B. cereus是动物及植物源性食品的主要污染物，其引起的食品中毒事件在国内外均有报道，中毒后可以导致胃肠功能紊乱、各种局部或全身性感染，如坏死性肠炎、肝功能衰竭、菌血症和脑膜炎[5-7]，但其最为常见的是导致腹泻型和呕吐型2 种类型的食物中毒，其中腹泻是由溶血素BL（Hbl）、非溶血性肠毒素（Nhe）、细胞毒素K（CytK）、肠毒素FM（EntFM）及肠毒素T（BecT）等肠毒素所引起的；呕吐是由一种小的环状热稳定十二肽毒素Ereulide引起的[8]。

病原菌的鉴定和分型对现代公共卫生传染病监测和疫情应对至关重要，及时、准确的菌株分型数据有助于快速检测到疾病爆发源，从而可以采取一定的控制措施，防止未来病原菌的爆发[9]。B. cereus的传统分型方法主要有生化分型、噬菌体分型、血清分型等，但存在操作繁琐、分型周期长、分辨率低等缺点。随着分子生物学的发展，B. cereus的分子分型方法越来越多，如多位点序列分型、重复序列聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）分型、随机扩增多态性DNA分型、脉冲场凝胶电泳分型等，这些分型方法有效地弥补了传统分型方法的不足。目前，B. cereus分型的研究处于起步阶段，本文对B. cereus分型方法的研究进展进行综述，以期为该菌的鉴定和分型提供一定的参考。

1 蜡样芽孢杆菌的传统分型方法

20世纪早期，细菌主要依据形态学进行鉴定，很难鉴定到种或亚种。为了对细菌进行细分，基于血清学、抗生素敏感性、噬菌体抗性、生化表型等的分型方法逐渐产生[10]。

噬菌体分型是一种基于噬菌体对宿主细菌感染和裂解具有高度特异性而进行分型的方法。1988年，姚敬业等[11]从水中获取13 株B. cereus噬菌体对中国16 个地区的121 株食品中毒株及602 株食品分离株进行了分型，结果显示723 株蜡样芽孢杆菌被分为41 个型别，其中型别C20、C30、C24、C27、C19及A4占的比重较大；食品中毒株的分型率为75%，以A4型最多见，明显高于食品分离株的分型率（51%）。噬菌体分型特异性较高，对病原菌的溯源具有一定的应用价值，但也存在操作繁琐、重复性差、个别菌株不能分型等不足之处，目前在B. cereus分型中应用较少。

目前，传统生化分型在B. cereus分型中占主要地位，依据GB 4789.14—2014《食品微生物学检验 蜡样芽孢杆菌检验》[1]，通过明胶液化实验、V-P实验、淀粉水解、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用，可将B. cereus分成15 个生化型别。李春等[12]于2015年对各类即食食品中分离的52 株B. cereus进行生化分型，结果表明4 株分离菌株不能分型，其余48 株B. cereus分离菌株分为7 个型，以2、8、9型为主，通过与ERIC-PCR分型结果相比发现这次实验的生化分型没有分子分型精确。理论上，生化分型可以为B. cereus的溯源提供一定的依据，但其操作复杂、所需试剂繁多、分型时间长，且有些菌株不能分型。

2 蜡样芽孢杆菌的分子分型方法

2.1 多位点序列分型

多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）是近年来发展比较迅速的分子分型方法，分辨能力较高，对病原体流行病学及进化学的研究具有重要意义[13]。这种方法通常是选取7 对管家基因并对每个基因450～500 bp的片段进行测序，将每个位点的序列上传至MLST网站进行分析，获取相应等位基因的编号，每一株菌的等位基因编号排列组合构成该菌的等位基因图谱或序列型（sequence typing，ST）[14-16]。MLST技术可以通过比较ST评估不同来源的菌株之间的亲缘关系，即亲缘关系比较近的菌株ST相同或仅有个别的基因座存在差异。2007年，Olsen等[17]运用改进的MLST对B. cereus群进行分型，通过对比adk基因片段的核苷酸序列实现了B. anth racis（炭疽芽孢杆菌）与B. cereus群内其他种的区分，为B. cereus群内种间鉴别提供了参考。2014年，刘勇[18]对大米中分离的13 株呕吐性B. cereus进行了MLST分型，结果显示11 株菌株为ST26序列型，这可为产呕吐毒素B. cereus的初筛提供依据；并发现了2 株新的呕吐性B. cereus序列型，丰富了呕吐型菌株的多样性，表明了呕吐性B. cereus在进化过程中正趋向于多样化。MLST方法准确度高、重现性好，便于实验室之前的数据比对分析，有利于追溯病原菌的传播途径和来源，但MLST对管家基因高度一致的菌株分型并不适合。

2.2 重复序列PCR分型

重复序列PCR（repetitive sequence-PCR，Rep-PCR）分型技术是Versalovic等[19]在1991年发明的一种基因组指纹分型方法。这种方法是以基因组的重复序列为引物进行PCR扩增，并用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析，最后基于电泳结果进行分型。目前常用于细菌分型有细菌基因外重复回文序列扩增（repetitive extragenic palindromic-PCR，REP-PCR）、肠内细菌基因组间重复序列扩增（enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-PCR，ERIC-PCR）和细菌基因组重复序列扩增（BOX-PCR）等[20-22]。2007年，López等[23]运用REPPCR、ERIC-PCR、BOX-PCR 3 种重复序列PCR方法对133 株B. cereus蜂蜜分离株进行分型，通过这3 种方法的结合可以把所有分离菌株分为7 个型，表明REP-PCR基因组指纹可用于表征B. cereus；这些数据也说明蜂蜜中分离B. cereus具有高度的基因多样性，表明B. cereus污染可能来自花粉、设备、灰尘等多个源头。2011年，Chaves等[24]运用REP-PCR对1980—2000年巴西的97 株食源性B. cereus进行分型，结果分为7 个主要型别（2 株及以上），表明这些菌株具有高度的基因多样性，且多样性随时间的推移一直保持；同时发现1型包括的菌株最多（10 株菌，9 株相似度为100%），并且这些菌株拥有除ces基因外的所有已知肠毒素相关基因，这可以为产肠毒素B. cereus的初筛提供参考。REP-PCR技术操作简单、快速，分辨率高，重复性好，可用于细菌的多样性研究，但有关研究表明，REP-PCR对相同来源菌株的分型有局限[25]。

2.3 随机扩增多态性DNA分型

随机扩增 多态性DNA（random amplifi ed polymorphic DNA，RAPD）分型是一种建立在PCR技术之上的基因组多态性检测方法。这种方法以基因组DNA为模板，采用随机选择的单一引物扩增基因组DNA，扩增产物经电泳分离、电泳结果分析可以实现对细菌的分型[26]。2010年，Thorsen等[27]运用RAPD对非洲发酵食品中的19 株B. cereus进行分型，结果分为2 个型，且2型的7 株B. cereus均可以产生呕吐毒素，说明RAPD分型方法可以用于产呕吐毒素B. cereus的识别。2012年，Oh等[28]运用RAPD对生米及米饭中分离的B. cereus群进行分型，结果发现B. cereus群的生米分离株的多样性多于B. cereus群的米饭分离株；并且，具有相同RAPD图谱的B. cereus群分离株一般会具有相似的毒性，这说明RAPD技术可能适用于B. cereus产毒素种类的判别。Hall等[29]于2012年运用RAPD技术对热巧克力饮料中的B. cereus群来源进行了分析，结果发现B. cereus群最主要的源头是巧克力粉，同时机器部件也是B. cereus群的一个来源，这为RAPD技术在B. cereus群溯源中的应用提供了依据。RAPD技术在B. cereus分型中的应用比较广泛，相对于扩增片段长度多态性、脉冲场凝胶电泳等技术来说具有简单、快速、多态性好等优点，但RAPD技术也存在一定的局限性，如稳定性和重复性较差[30]。

2.4 扩增片段长度多态性分型

扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）分型是基于PCR技术的基因组限制性片段长度多态性检测方法。该方法是通过限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，形成大小不同的DNA片段，再用双链寡核苷酸接头连接酶切片段， 然后设计引物对连接后片段进行扩增，最后通过电泳检测扩增后的DNA片段[31-32]。2011年，Tourasse等[33]通过结合2 214 株分离菌株的AFLP与多位点序列分型、多位点酶电泳分型数据对B. cereus群进行分析；结果表明B. cereus群中可以发现来源不同且亲缘关系非常近的新群，同时发现了来自食品的B. cereus分离菌株可以与临床、环境等其他来源的B. cereus分离菌株基因型相同，这是之前所不被认可的。AFLP具有多态性强、稳定性和重复性好等优点，但AFLP技术所用引物取决于接头，对接头技术要求较高，所以目前运用AFLP对B. cereus分型的研究并不多见[34]。

2.5 脉冲场凝胶电泳分型

脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）技 术是1984年Schwartz等[35]发明的一种电泳技术，用于分离大片段线性DNA分子。这种方法的原理是DNA分子在交替变换的脉冲电场下泳动方向发生改变，且不同分子质量的DNA分子定向速率不同，分子质量小的DNA分子比大的DNA分子重新定向快、在凝胶中移动速率快，最终可以分离大小不同的DNA片段，达到分型的目的[36]。2011年，Kim等[37]运用PFGE对39 株产呕吐毒素B. cereus（35 株临床分离菌株和4 株食品分离菌株）及3 株产肠毒素B. cereus参考菌株进行分型，结果发现在70%的相似性水平下分为17 个型，且临床分离菌株的电泳条带多于食品分离菌株；通过结合生物学特性、PFGE型、RAPD型及抗生素耐药型数据，这些菌株被分为7 个型，其中7型由3 株产肠毒素B. cereus参考菌株组成，5型和6型涵盖了大部分的产呕吐毒素B. cereus，且5型均为临床分离株，说明PFGE分型与其他分型方法结合可以把产肠毒素B. cereus与产呕吐毒素B. cereus区分开，同时也可以用于区分部分临床分离菌株和食品分离菌株。PFGE技术具有分辨率强、重复性好等优点，广泛应用于病原菌的溯源、临床及医学等方面，但该方法耗时长、成本高、易受主观因素的影响，目前在B. cereus分型中的应用并不广泛。

2.6 全基因组测序分型

全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）技术是基于细菌的整个基因组对细菌进行分型的方法，该方法对流行病学的调查至关重要，并且将来可能会应用于临床[38-39]。近年来，随着一些技术手段的发展，WGS技术正趋向于低成本、高通量。然而WGS技术最大的挑战不在于测序的成本及实施的复杂性，而在于大量数据的产生[9,40]。运用WGS技术对微生物分型的重要条件是有一个可利用的网络生物信息和数据储存平台，且该平台储存的WGS参考数据库能逐渐增多。目前鲜见运用WGS技术对B. cereus进行分型的报道，但随着B. cereus研究的不断深入以及WGS技术的发展，运用WGS技术对B. cereus进行研究将有很广阔的空间[41]。

2.7 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分型

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ion ization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技术作为新兴的技术，其应用于菌种鉴定和分型中的研究越来越多。这种方法主要是通过检测微生物的核糖体蛋白质的质谱数据，与已知微生物的质谱数据比对进行菌种鉴定，并基于质谱数据聚类而进行分型[42]。MALDI-TOF-MS鉴定速率快，100 个样品从点样到分析出结果，大约需要1 h，同时该方法还具有操作简单、高通量、重复性好等优点，但该方法也存在仪器比较昂贵、成本高、对微生物的纯度要求高等缺点[43]。目前，运用MALDI-TOF-MS方法对B. cereus进行鉴定和分型的研究鲜见报道，但该技术应用于其他细菌的报道已经很 多，Espinal等[44]运用MALDI-TOF-MS技术对不动杆菌属分离株的不同种进行了区分，为其他细菌的分型提供了参考；赵贵明等[45]运用MALDI-TOF-MS技术实现了对克罗诺杆菌的鉴定和分型，并且其分型结果与分子分型结果一致，进一步说明了该方法的准确性和发展空间。尽管目前MALDI-TOF-MS技术存在一些局限，但该方法高效率、高通量等优点决定其必将成为B. cereus分型技术发展的一个趋势。

3 结 语

本文对B. cereus的噬菌体分型、生化分型等传统分型方法以及MLST、Rep-PCR、RAPD、PFGE等分子分型方法的研究进展进行了概述。MLST技术应用范围较广，几乎适用于所有种属的细菌，目前MLST多用于B. cereus群内B. anthracis、B. cereus、苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）等各个种的区分，也常用于产呕吐毒素B. cereus的识别，研究发现序列型ST26是产呕吐毒素B. cereu s的优势菌株[18]。MLST可实现数据在全球范围内共享，提高了核酸序列变异分析的可靠性和自动化，随着测序技术的发展和成本的下降，MLST将会在B. cereus鉴定、分型发挥更大的作用[46]。REP-PCR分型是一种有效的基因分型方法，在微生物鉴定、分型及亲缘关系研究中有广阔的前景，比较适用于B. cereus分型。但REP-PCR的分型效果易受反应体系、循环参数等外界因素的影响，所以需要 建立一种高效、稳定的REP-PCR分型体系，从而实现对B. cereus的高效、准确的分型[47]。RAPD技术在微生物的分类鉴定、溯源等方面应用广泛，目前多用于芽孢杆菌的多样性研究。Oguntoyinbo等[48]结合RAPD和核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析技术实现了对芽孢杆菌属内B. cereus、B. subtilis、B. licheniformis等的区分。AFLP和PFGE技术虽有诸多优势，但目前在B. cereus分型中的应用并不普遍，常与其他分型方法结合对B. cereus进行分型。

随着科技的发展，越来越多的细菌分型方法应运而生，逐渐向高效率、低成本、高分辨率、高通量的方向发展。选择合理的B. cereus分型方法有利于该菌的溯源，从而预防和控制该菌引起的食源性疾病。

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Advances in Methods for Bacillus cereus Typing

CAO Feiyang1,2, WANG Ping1, JIANG Lianzhou2, CHEN Ying1,*
(1. Agro-Product Safety Research Center, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China; 2. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Bacillus cereus is a food-borne opportunistic pathogen widely present in the environment and foods. It is frequently associated with two types of food-borne illness: emesis and diarrhea. The study on Bacillus cereus typing has important implications for the prevention, early warning, tracing and molecular epidemi ological survey of Bacillus cereus. Currently, the popular methods for typing Bacillus cereus include traditional typing methods such as phage typing and biochemical typing, and molecular typing methods such as multilocus sequence typing, repetitive sequence-PCR, random amplifi ed polymorphic DNA, and pulsed-fi eld gel electrophoresis. In this paper, all these methods are reviewed with the aim of providing references for the typing of Baci llus cereus.

Bacillus cereus; traditiona l typing methods; molecular typing methods

10.7506/spkx1002-6630-201717046

TS207.4

A

1002-6630（2017）17-0286-05引文格式：

2016-07-28

“十三五”国家重点研发计划重点专项（2016YFD0401102）；中国检验检疫科学研究院院所基金项目（2016JK006）作者简介：曹飞扬（1989—），男，硕士，研究方向为食品质量安全检测与控制。E-mail：feiyangc@163.com

*通信作者：陈颖（1972—），女，研究员，博士，研究方向为食品质量安全与控制。E-mail：chenyingcaiq@163.com