白毛藤多糖联合阿霉素对乳腺癌细胞凋亡的影响※

● 杨旭东 张 杰 杨清东 杨骄霞 王桂云 崔荣军 刘洪凤

白毛藤多糖联合阿霉素对乳腺癌细胞凋亡的影响※

● 杨旭东1*张 杰1▲杨清东1杨骄霞2王桂云1崔荣军1刘洪凤1

目的:探讨白毛藤多糖(Solamum lyratum Thunb polysaccharide，SLTP)联合阿霉素(Adrismycim，ADM)对人乳腺癌MCF－7细胞凋亡的影响及其分子机制。方法:实验分为空白对照组、ADM组、ADM+低剂量SLTP组，ADM+中剂量SLTP组，ADM+高剂量SLTP组。通过RT－PCR检测各组Bcl－2、Fas基因表达量的变化，同时应用荧光显微镜观察人乳腺癌细胞MCF－7细胞凋亡情况。结果:与空白对照组比较，ADM组及ADM+高中低剂量SLTP组细胞凋亡率增加，并且上调Fas和降低Bcl－2表达。结论:阿霉素及阿霉素联合白毛藤多糖促进其MCF－7细胞凋亡，其机制可能与激活Fas、抑制Bcl－2的基因表达有关。

白毛藤多糖 阿霉素 乳腺癌 Fas Bcl－2

乳腺癌即乳腺恶性肿瘤，是女性常见的恶性肿瘤之一，治疗方式以手术治疗为主。对于无法手术治疗的患者，如何一方面保证化疗药物的疗效，一方面减少化疗药物的毒副作用，一直是临床上恶性肿瘤化疗过程中亟待解决的问题。白毛藤(Solamum lyratum Thunb)是茄科植物白英的全草，传统中医认为其有清热、利湿、解毒、消肿之功用［1］。本课题组前期实验表明，白毛藤对多种肿瘤细胞具有增殖抑制作用［2－3］，本研究进一步观察白毛藤多糖(Solamum lyratum Thunb polysaccharide，SLTP)联合阿霉素(Adrismycim，ADM)对人乳腺癌MCF－7细胞增殖的影响及其分子机制，为SLTP应用于乳腺癌的辅助化疗，降低化疗药物的毒副作用提供实验依据。

1 材料

1.1 乳腺癌细胞株 人乳腺癌MCF－7细胞株购于武汉中美科技有限公司，按细胞库要求培养细胞。

1.2 主要试剂 RT－PCR试剂盒及相关试剂购于大连宝生物有限公司(批号:DRR019A);胰酶(批号: 1606137)、引物购于上海生工生物工程公司;DMEM培养基(批号:12491013)、胎牛血清(批号:1527494)、Trizol(批号15596－026)购于美国Gibco公司，4℃保存;MTT细胞增殖分析试剂盒购于Sigma公司(批号: PB11058)。

2 方法

2.1 药物的制备 白毛藤清洗匀浆、醇提、沉淀，留取沉淀再溶解、再沉淀、离心分离。蒸馏水溶解固体部分，加入等体积氯仿/正丁醇混合液(4∶1)，振荡混匀20min，沉淀，取上清，去除蛋白，重复操作3次。取上清，再醇析(4倍乙醇)，取沉淀用乙醚、丙酮依次洗涤，冷冻干燥，即得SLTP。

2.2 细胞培养与分组 精确称取适量SLTP溶解于10%胎牛血清的 DMEM培养液中配置成16mg· mL－1SLTP的母液，4℃储存，应用时按比例稀释。MCF－7细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，37℃，5%CO2培养箱中培养。调零组:不含细胞的培养液;空白对照组:用含MCF－7细胞的培养液;ADM组:1mg·L－1ADM;ADM+低剂量SLTP组: 1mg·L－1ADM+0.4mg·mL－1SLTP;ADM+中剂量SLTP组:1mg·L－1ADM+0.8mg·mL－1SLTP; ADM+高剂量SLTP组:1mg·L－1ADM+1.6mg· mL－1SLTP。

2.3 MTT方法检测细胞的药物敏感性 以每孔150μL将密度为1×105个·mL－1的MCF－7细胞接种于96孔培养板中。分别加入不同浓度药物20μL，每组设5个复孔，另外设不加药物的空白对照组。细胞培养12、24、48h后，除调零组外各组分别加入20μL MTT(5g·L－1);培养4h后，弃去MTT液，加DMSO150μL/孔，全自动酶标仪490nm波长，测定光密度值(OD值)。计算肿瘤细胞抑制率(inhibition rate，IR)。IR=(对照组OD－实验组OD)/(对照组OD－空白组OD)×100%。

2.4 细胞凋亡检测 MCF－7细胞以3×105·mL－1的浓度，接种于6孔培养板中，1mL/孔。CO2培养箱孵育细胞24h后，加入相应药物，对照组加相同体积新鲜培养液。48h后胰酶消化细胞制成细胞悬液，0.01mol·L－1PBS漂洗 3遍，固定液 4℃固定细胞10min，弃固定液，0.01mol·L－1PBS漂洗细胞3次，5min/次，干燥后，在37℃、5%CO2培养箱中，用5mg ·L－1Hoechst33258染色液染色15 min，取出盖玻片，用甘油与PBS比例为1:9的混合性封片剂封片，荧光显微镜观察。计算细胞凋亡率，细胞凋亡率=［凋亡细胞/(凋亡细胞+正常细胞)］×100%。

2.5 RT－PCR检测 总RNA的提取，将各组细胞中加入1mL Trizol，用移液管吹打混匀，移入Ep管，15～30℃放置5min。每管加入0.2ml氯仿，震荡混匀，室温放置3min。12000 r·min－1、4℃，离心15min，上清移入新Ep管，加0.5mL异丙醇，混匀，静置10min。12000r·min－1、4℃、离心 5min，弃上清液，加入1mL4℃75%乙醇(DEPC水配制)，震荡使RNA沉淀重新悬浮。7500r·min－1、4℃，离心5min，弃上清，静置10min，加入DEPC水20μL混匀、溶解RNA，分光光度计测定A260/A280为1.8－2.0，RNA产物置于－80℃冰箱保存。PCR扩增引物如下:Fas上游引物序列为:5'－CGCCTATGGTTGTTGTTGACC－3';Fas下游引物序列为:5'－CCTCTGTTACGACCTC－3'，扩增产物Fas的长度为477bp。Bcl－2上游引物序列为:5'－GACTTCTCGTCGCTACCGTC－3';Bcl－2下游引物序列:5'－ACATGCACCTACCCAGCCTCCGTTATC－3'，扩增产物Bcl－2长度为296bp。β－actin上游引物序列为:5'－ATGTGGCACCACACCTTCTA－3'，β－actin下游引物序列为:5'－CGTCATACTCCTGCTTGCTG－3'，扩增产物β－actin片段为838bp。PCR反应条件:94℃、5min，预变性，1个循环;94℃、5min，变性，54℃、50s，退火，72℃、90s，延伸，35个循环;72℃、10min，延伸，1个循环。琼脂糖凝胶电泳后拍照，软件分析Bcl－2、Fas mRNA的相对表达量。

3 结果

3.1 MTT实验测定药物敏感性 实验结果显示，高中低剂量的SLTP分别与ADM合用对乳腺癌细胞都有明显的抑制增殖作用，其作用效果比单用ADM效果明显。见表1。

表1 细胞生长抑制率(%±s)

表1 细胞生长抑制率(%±s)

注:与ADM组比较，＊＊P＜0.01，*P＜0.05。

组别12 h 24 h 48 h空白对照组ADM组ADM+低剂量SLTP组ADM+中剂量SLTP组ADM+高剂量SLTP组———5.460.03 9.180.04*15.070.13*19.730.21＊＊7.430.21 10.790.52*23.610.84＊＊27.060.53＊＊13.611.31 18.471.44*26.641.71＊＊31.141.87＊＊

3.2 细胞凋亡情况 荧光显微镜下可见空白对照组细胞核形态完整。不同浓度药物作用于乳腺癌MCF－7细胞48 h后，荧光标记的凋亡细胞，细胞核呈蓝色深染、细胞核碎裂等情况。各组细胞的凋亡率各不相同，与空白对照组凋亡率(3.76%)比较，ADM组凋亡率(6.37%)明显升高，说明ADM可以诱导乳腺癌MCF－7细胞凋亡;ADM+低剂量SLTP组凋亡率为9.03%，ADM+中剂量SLTP组凋亡率为11.41%，ADM+高剂量SLTP组凋亡率为15.43%，与空白对照组比较，ADM+高剂量SLTP组肿瘤细胞的凋亡率升高最明显(P＜0.01)。

3.3 ADM联合SLTP对Bc1－2和Fas基因表达影响

肿瘤细胞中抑制细胞凋亡的Bcl－2基因的表达情况(见图1及表2):与空白对照组比较，药物作用48h后，ADM组Bcl－2基因表达减少(P＜0.05)，ADM+低剂量SLTP组、ADM+中剂量SLTP组、ADM+高剂量SLTP组Bcl－2基因表达降低，效果更显著(P＜0.01);肿瘤细胞中促进细胞凋亡的Fas基因的表达情况(见图2及表2):与空白对照组比较，药物作用48h后，ADM组Fas基因表达增加(P＜0.05)，ADM+低剂量SLTP组、ADM+中剂量SLTP组、ADM+高剂量SLTP组Fas基因表达增加，效果更显著(P＜0.01)。

表2 ADM联合SLTP对Bc1－2和Fas基因表达影响(±s)

表2 ADM联合SLTP对Bc1－2和Fas基因表达影响(±s)

注:与空白对照组比较，＊＊P＜0.01，*P＜0.05。

组别 Bcl－2/β－Actin Fas/β－Actin空白对照组ADM组ADM+低剂量SLTP组ADM+中剂量SLTP组ADM+高剂量SLTP组0.63±0.04 0.46±0.03*0.32±0.03＊＊0.28±0.02＊＊0.21±0.01＊＊0.13±0.01 0.29±0.02*0.37±0.02＊＊0.42±0.03＊＊0.56±0.04＊＊

图1 ADM联合SLTP对Bc1－2基因表达影响

图2 ADM联合SLTP对Fas基因表达影响M.DNA Marker;A.空白对照组;B.ADM组;C.ADM+低剂量SLTP组; D.ADM+中剂量SLTP组;E.ADM+高剂量SLTP组

4 讨论

乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，目前已成为威胁女性健康的常见肿瘤之一［4、5］。大多患者通过乳腺癌根治术治疗，但由于乳腺癌细胞之间连接松散，易脱落，可随血液或淋巴液播散全身，形成转移，危及生命。对于无法采用手术治疗的患者或术后恢复的患者往往辅助化疗治疗肿瘤。化疗药物在杀灭肿瘤细胞同时损伤正常组织细胞，因此提高化疗药物的敏感性至关重要，在保证治疗效果的同时又降低了化疗药物毒副作用。细胞的无限制生长可导致肿瘤的发生，其原因是细胞的过度增殖和细胞凋亡的减少，因此调控抗凋亡基因及凋亡基因的表达成为了肿瘤治疗中的一个潜在的靶点。Bcl－2基因最早在研究B细胞淋巴瘤中发现的，其位于18q21，具有明显的抑制细胞凋亡的作用，是Bcl－2家族中最具代表的抗凋亡蛋白。其通过调控线粒体途径、影响细胞膜跨膜转运、激活谷氨酰胺转移酶、改变钙离子分布等机制调控凋亡，因此，Bcl－2蛋白的表达情况可以在一定程度上反映细胞凋亡的程度［6－8］。实验研究表明Bcl－2等凋亡相关基因的异常表达是导致肿瘤化疗耐受的重要原因之一［9－10］。因此药物是否能有效抑制Bcl－2等凋亡相关基因的异常表达，将能提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，降低化疗的抵抗。Fas蛋白是一种细胞膜表面受体蛋白，在细胞凋亡中起重要的作用，分子量为45kd，位于人染色体的10q24.1，与活化的T淋巴细胞表面的配体Fas－L蛋白结合，向细胞膜内传递死亡信号，诱导细胞凋亡［11］。

本研究结果显示:高中低剂量的SLTP分别与ADM合用可明显抑制乳腺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，提高ADM的药物疗效;并且SLTP能明显上调Fas基因表达，下调Bcl－2基因表达，其作用效果比单用ADM效果明显。表明SLTP可能通过调节Bcl－2及Fas基因表达的平衡，增加肿瘤细胞对ADM的敏感性，促进ADM诱导乳腺癌细胞的凋亡。为SLTP应用于乳腺癌的辅助化疗提供实验依据，然而其协同作用机制仍需进一步研究。

［1］冯洪钱.民间兽医本草［M］.北京:科学技术文献出版社，1993:307－308.

［2］杨旭东，张 杰，杨骄霞.白毛藤对人乳腺癌MCF－7细胞凋亡的影响［J］.中国现代中药，2010，12(4):34－36.

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黑龙江省中医药管理局中医药科研项目(No.ZHY10－W71);牡丹江医学院科学技术研究项目(No.ZS201314)

杨旭东，男，副教授。主要从事中药的药理与毒理研究。

▲通讯作者张杰，女，硕士。主要从事中药的药理与毒理研究。E－mail:zhangjie03mdj@126.com

1.黑龙江省牡丹江医学院(157011);2.黑龙江省牡丹江医学院附属红旗医院(157011)