吗啡及可待因酶联免疫检测方法的研究

杨昌松，张林田，冯静，王琳琛，孔祥雅，何方洋*

（1.北京勤邦生物技术有限公司，北京102206；2.汕头出入境检验检疫局，广东汕头515041）

吗啡及可待因酶联免疫检测方法的研究

杨昌松1，张林田2，冯静1，王琳琛1，孔祥雅1，何方洋1*

（1.北京勤邦生物技术有限公司，北京102206；2.汕头出入境检验检疫局，广东汕头515041）

通过对吗啡分子结构进行改造，制备了吗啡半抗原及人工抗原，通过免疫动物得到了吗啡的单克隆抗体，建立了吗啡及可待因间接竞争酶联免疫检测方法。该方法对火锅底料和辣椒酱的检出限分别为4.92 μg/kg、4.85 μg/kg，半抑制浓度(IC50)为0.7 μg/L，标准曲线线性范围为0.3～24.3 μg/L。抗体与吗啡、可待因的交叉反应率分别为100%、150%。火锅底料、辣椒酱样品中平均添加回收率为80%～120%，变异系数＜15%。

吗啡；可待因；酶联免疫检测；火锅底料；辣椒酱

罂粟壳是罂粟科植物罂粟割取浆汁后的干燥成熟果壳，内含吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可汀等20多种生物碱[1]。吗啡等在医院可作为镇痛药使用，但若长期食用会成瘾并出现乏力、犯困、发冷、面黄肌瘦，甚至损坏神经系统、消化系统，导致内分泌失调[2-3]。在我国，罂粟壳是禁止在食品及调味品中添加使用的，但有少数商家为了达到盈利目的，在火锅底料及调味料中添加罂粟壳，严重危害了消费者的身体健康[4]。

检测罂粟壳中生物碱的方法主要有化学显色法、薄层层析检测法、高效液相色谱检测法和气质联用色谱检测法等[5-10]。这些方法各有特点，前两者灵敏度和精密度均不高；后两者虽有较高的灵敏度及精密度，但检测成本高、操作复杂、不能现场操作。与之相比，利用免疫学原理发展起来的酶联免疫方法具有专一性强、灵敏度高、操作简便、检测成本低、可适合于大规模检测等优点，但国内关于这种检测方法的报道尚不多见。本研究通过化学合成具有抗原活性的吗啡免疫抗原，成功获得了高特异性、高亲和性的吗啡单克隆抗体，该单抗与可待因交叉反应率达150%，同时开发了检测火锅底料及辣椒酱中吗啡及可待因的酶联免疫吸附检测（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒，为检测机构和生产厂家提供了高效、快速的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

吗啡、可待因、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）：美国Sigma公司；包被液（0.05 mol/L碳酸盐缓冲液pH 9.6）、洗涤液（含1%吐温的0.02 mol/LPBS pH 7.6）、封闭液（含0.05%BSA的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）pH 7.6）：北京化学试剂公司；8周龄的雌性Balb/C小鼠、无病原体羊：北京勤邦生物技术有限公司；火锅底料、辣椒酱：市售。

1.2 仪器与设备

MK3酶标仪：上海雷勃分析仪器有限公司；Costar酶标板：北京诺博莱德科技有限公司；TDL-40B离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 抗原的制备

（1）半抗原的制备

取3-氟-4硝基苯胺20 mg，加2 mol/L的稀硫酸200 μL，加水，搅拌溶解，5℃，加入亚硝酸钠18 mg，搅拌1 h，得到重氮盐溶液；取吗啡15 mg，加2 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠乙醇溶液溶解，加入到重氮盐中，反应2 h，停止反应，离心分离，得到红色固体化合物，加乙醇旋蒸，蒸干除去水分，加二氯甲烷：石油醚（1∶20，V/V）洗涤结晶得到半抗原产物。苯酚的羟基在空间的位置影响苯酚的能量和原子电荷密度，在它的作用下苯环的邻、对位碳原子的负电荷比苯环碳原子高，亲电试剂Me+与苯酚反应形成邻、对位的碳正离子中间体比间位碳正离子中间体稳定[11]，吗啡与重氮盐链接位置如图1所示。

图1 吗啡半抗原的合成Fig.1 Synthesis of morphine hapten

（2）免疫原的制备

取11 mg半抗原，溶解于1 mL纯度99.9%的二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）中；称取50 mg BSA，使之充分溶解在3.8 mL 0.1 mol/L PBS（pH 9.6）中，将溶解好的半抗原逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24 h，用0.01 mol/L PBS 4℃透析3 d，透析袋截留分子质量8 000～14 000 u，每8 h换3次透析液；分装，于-20℃保存备用。

（3）包被原的制备

包被原的合成方法同免疫原的合成，载体蛋白为OVA，其他步骤相同。

1.3.2 单克隆抗体的制备及效价验证

将免疫原—吗啡半抗原-BSA偶联物与等量弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的Balb/c小鼠，0.2 mL/只；每两周换用弗氏不完全佐剂乳化加强免疫；最后一次加强免疫一周后采眼底静脉血，有抑制且效价达到1∶10000以上时进行腹腔注射0.1 mL免疫原溶液，3 d后取鼠脾脏与骨髓瘤细胞融合[12-13]。使用间接竞争酶联免疫分析方法筛选阳性细胞上清液。建立稳定分泌吗啡单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用体内诱生法，将灭菌石蜡油0.5 mL/只注入Balb/c小鼠（8周龄）腹腔内，7 d后注射杂交瘤细胞5×105个/只于腹腔内，7 d后采集腹水并使用辛酸-饱和硫酸铵法纯化，得到吗啡单克隆抗体溶液[14]，-20℃保存。

1.3.3 制备酶标记抗体

用1.3.2步骤得到的吗啡单克隆抗体免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗体，然后将羊抗鼠抗体与HRP偶联，即得到酶标记抗体。

1.3.4 优选抗原包被浓度、单克隆抗体浓度，制备酶标板

抗原稀释倍数依次为：1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000；单克隆抗体稀释倍数依次为：1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000、1∶160 000；酶标记抗体液的稀释倍数为1∶1 000；测定波长为450 nm，分别测定0、0.3 μg/L质量浓度的吗啡标准品的吸光度值，并按如下公式计算百分吸光率（抑制率）：

在酶标板包被100 μL/孔抗原包被液，37℃孵育2 h，随后清洗酶标板，再加入150 μL/孔封闭液，37℃孵育2 h，即制备完成酶标板。

1.3.5 样本的前处理方法

称取1g均质火锅底料或辣椒酱样品至50mL离心管中，加入10mL无水乙醇，涡动5min，3000×g室温离心5min；取1mL上层有机相于50～60℃水浴氮吹至干；加入1 mL正己烷，涡动至溶解，再加入复溶液1 mL，涡动至均匀；4 500×g室温离心2 min；去除上层油脂层及乳化层，取下层50 μL用于分析。

1.3.6 标准曲线的建立

用0.02 mol/L PBS将吗啡稀释成0、0.3 μg/L、0.9 μg/L、2.7 μg/L、8.1 μg/L、24.3 μg/L共6个质量浓度，加入酶标板中，50 μL/孔，然后加入酶标二抗50 μL/孔，再加入抗体工作液50 μL/孔，25℃避光环境下竞争30 min。洗板拍干后加入底物液100 μL/孔25℃避光反应15 min，最后每孔加入50 μL终止液，于波长450 nm处检测[15-16]。标准曲线的横坐标为吗啡标准品质量浓度的对数值，纵坐标为百分吸光度值B（其他浓度孔的显色值）/B0（0 μg/L孔的显色值），重复测定5板，每板各浓度设5个重复，以测定批内和批间误差。

1.3.7 样品中吗啡及可待因的检测

根据1.3.6测定所得的标准曲线，将火锅底料或辣椒酱样本的OD450nm值代入标准曲线，即可得到其相应的质量浓度，用该质量浓度乘以稀释倍数即样本中吗啡及可待因残留量。

1.3.8 检测性能

（1）计算检出限

测定火锅底料、辣椒酱空白样本各20份，计算其标准差，以测定平均值加3倍的标准差作为方法的检测限（limit of detection，LOD），即可检测出的最低被测物浓度。

（2）精密度及准确度

按5 μg/kg、10 μg/kg、20 μg/kg三个浓度的吗啡及可待因对火锅底料、辣椒酱样品进行添加回收测定，每个样品浓度做4个重复，用三批不同试剂盒进行测定。准确度评价以回收率作为指标；精密度评价以重复测定某一浓度样品的检测结果的变异系数作为指标。

（3）测定抗体的特异性

分别测定吗啡、可待因、蒂巴因、那可汀、罂粟碱与抗体的结合反应。交叉反应率为吗啡的IC50与这些物质的IC50的百分比，决定了它们对吗啡检测的干扰程度。

2 结果与分析

2.1 吗啡人工抗原的检测结果

取合成的半抗原经核磁共振氢谱鉴定，结果见图2。由图2可知，1H-NMR（CDCl3，300MHz）δ：8.40（s，1H，ArH），7.90（s，1H，ArH），7.62（s，1H，ArH），6.82（s，1H，ArH），5.90（s，1H，-CH-），5.59（s，1H，-CH-），5.35（s，1H，-OH），4.30（d，1H，CH），3.04（s，1H，CH），2.76（s，1H，-CH-），1.88（d，2H，-CH2-）。图谱中化学位移δ=8.40、7.90、7.62为间隔臂苯环上氢的共振吸收峰，这些峰的存在，证明间隔臂连接成功，吗啡半抗原结构正确。

图2 吗啡半抗原核磁共振氢谱图Fig.2 Hydrogen spectrogram of nuclear magnetic resonance of morphine hapten

2.2 优选抗原包被浓度、单克隆抗体浓度

测定不同单克隆抗体稀释倍数以及抗原稀释倍数条件下，质量浓度为0和0.3 μg/L的吗啡标准品的OD450nm值，并计算百分吸光率，结果见表1。

表1 抗原、抗体的浓度优选结果Table 1 Optimum results of antigen and antibody concentration

由表1可知，当百分吸光率在70%～85%时，以抗原、单克隆抗体的最大稀释倍数作为抗原、单克隆抗体的最佳稀释倍数，结果表明，此次筛选的抗原稀释倍数为8 000，最佳单克隆抗体稀释倍数为80 000。

2.3 标准曲线

如图3所示，标准曲线半抑制浓度（50%inhibitory concentration，IC50）为0.7 μg/L，检测范围为0.3～24.3 μg/L。

2.4 标准曲线的批内、批间误差

标准曲线的精密度用批内误差和批间误差来表示，重复测定5板，每板各浓度设5个重复，结果分别见表2和表3。

图3 吗啡标准曲线Fig.3 Standard curve of morphine

表2 标准曲线的批内误差Table 2 Intra-assay error of the standard curve

表3 标准曲线的批间误差Table 3 Inter-assay error of the standard curve

由表2可知，各浓度的批内变异系数（coefficient of variation，CV）在3.74%～7.84%，平均为5.85%。由表3可知，批间误差在3.98%～8.77%，平均为6.49%。结果表明，标准曲线的重复性良好。

2.5 计算检测限

20个火锅底料、辣椒酱空白样本中吗啡的检测结果分别见表4、表5。检测限以测定平均值加3倍标准差计算。

表4 火锅底料空白样本检测限测定结果Table 4 Detection results of limit of detection of hotpot condiment blank samplesμg/kg

表5 辣椒酱空白样本检测限测定结果Table 5 Detection results of limit of detection of chilli sauce blanks amplesμg/kg

由表4、表5可知，20个火锅底料空白样本中吗啡的检测结果平均值为3.34 μg/kg，最低检测限为4.92 μg/kg；20个辣椒酱空白样本中吗啡的检测结果平均值为3.00 μg/kg，最低检测限为4.85 μg/kg。

2.6 精密度及准确度试验

样本中吗啡及可待因的残留量测定，要求有可靠合理的检测方法，并有较高的灵敏度。在火锅底料、辣椒酱中按照设定的量分别添加吗啡及可待因标准品，然后按照1.3.7的方法测定。试验精度及准确试验结果见表6。由表6可知，试验结果平均回收率在80%～120%之间；批内、批间变异系数均＜15%，说明此检测方法是可靠的，可用于吗啡及可待因在火锅底料、辣椒酱中残留量的分析测定。

表6 精密度及准确度试验结果Table 6 Results of precision and accuracy tests

2.7 抗体的特异性测定

单克隆抗体与吗啡、可待因、蒂巴因、那可汀、罂粟碱的交叉反应率见表7。

表7 抗体与其他物质的交叉反应率Table 7 Cross-reaction rate of antibody and other substances

由表7可知，吗啡单克隆抗体对其他几种类似物的交叉反应率均较低，对吗啡和可待因具有较好的特异性。

2.8 讨论

吗啡是小分子，不具备免疫原性，制备吗啡特异性抗体首先要通过连接臂将吗啡与载体蛋白偶联。王能东等[17]设计了5种不同的连接臂得到了5株吗啡单克隆抗体的细胞株，其中43C4效果最好，IC50为30 μg/L。本研究所用吗啡半抗原是由重氮盐与吗啡反应得到，使用所得单克隆抗体建立的检测方法，IC50为0.7 μg/L。

在样本的检测分析中，为保证定量检测结果的准确性，需要最大程度的将吗啡组分从固体样本中提取出来。鲍会梅[18]比较了甲醇溶解法、反提法、磷酸缓冲液提取法、不同pH值的盐酸水溶液提取等方法，其最终确定甲醇溶解法最适用于吗啡的液相色谱分析。本研究采用了乙醇溶解法，经过水浴氮吹至干后，再加入正己烷去除油脂层及乳化层，对火锅底料、辣椒酱样品中平均添加回收率为80%～120%。

3 结论

酶联免疫法具有灵敏度高、特异性好、操作简单、成本低、高通量等特点，能够满足食品企业及政府监督部门的检查工作需求。本研究所建立的吗啡及可待因间接竞争酶联免疫检测方法，检测时间可短至45 min，试剂盒的标准曲线范围为0.3～24.3 μg/L，对火锅底料和辣椒酱的检出限分别为4.92μg/kg、4.85μg/kg，平均回收率在80%～120%；批内、批间变异系数均＜15%，可用于火锅底料、辣椒酱中吗啡及可待因的快速检测。

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ELISA for determination of morphine and codeine

YANG Changsong1,ZHANG Lintian2,FENG Jing1,WANG Linchen1,KONG Xiangya1,HE Fangyang1*
(1.Beijing Kwinbon Biotechnology Company,Beijing 102206,China;2.Import-Export Inspection and Quarantine Bureau of Shantou, Shantou 515041,China)

Morphine hapten and artificial antigen were prepared by transformation of morphine molecular structure.Morphine monoclonal antibodies were obtained by immune animals.The detection method of indirect competition enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)was established.The limit of detection of hotpot condiment and chilli sauce were 4.92 μg/kg and 4.85 μg/kg,respectively.The half-inhibitory concentration(IC50)was 0.7 μg/L.The linearity range of standard curve was 0.3-24.3 μg/L.The cross-reaction rate of antibody with morphine and codeine were 100%and 150%,respectively.The average adding standard recovery rate of hotpot condiment and chilli sauce was 80%-120%,the coefficient of variation was less than 15%.

morphine;codeine;enzyme immunoassay;hotpot condiment;chilli sauce

TS207.3

0254-5071（2017）03-0170-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.034

2016-12-14

汕头市农业攻关计划项目（汕市财教[2015]103）

杨昌松（1986-），男，研究员，本科，研究方向为食品安全快速检测技术。

*通讯作者：何方洋（1969-），男，研究员，博士，研究方向为食品安全快速检测技术。