烟叶蛋白高效降解菌的筛选鉴定及其作用效果研究

杨宗灿 Zong-can 冯颖杰 - 刘 超 王鹏飞 - 张 展 张耀广 - 杨永锋 - 李家美 - 刘向真 - 王红霞 -

(1. 河南中烟工业有限责任公司技术中心，河南 郑州 450000；2. 河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450000)

蛋白质是烟叶中主要的含氮化合物[1]，其含量对烟叶的吸食品质影响较大，对烟气饱满和烟香的丰富性具有重要作用。但是，蛋白质含量过高会导致烟叶在燃吸时产生似燃烧羽毛的臭味，并产生辛辣、苦涩感[2]。同时，蛋白质还是烟叶中许多有害成分的前体物质[3-5]。一般来说，优质烤烟的蛋白质含量在7%～11%[6]，而目前中国国产烤烟蛋白质含量普遍较高，尤其是河南产区的烟叶。因此有效降低烟叶蛋白质，使其维持在合理范围，是提高烟叶品质的重要途径。

蛋白质属于大分子化合物，在自然陈化条件下降解缓慢，通过生物技术加速降解烟叶蛋白具有重要意义。目前的研究[7-8]主要集中在酶法降解和微生物发酵降解，前者具有降解时间短、降解效率高的优势，但蛋白酶成本较高，导致其难以在工业中大规模的应用；而后者以成本低廉和工艺简单成为了当前的研究热点。李梅云等[9]将微球菌属或杆菌属的细菌在浓度为107CFU/mL时处理K326片烟，蛋白质降解率最高时为24.46%；马玲玲[10]从烟叶表面筛选出一株枯草芽孢杆菌，喷施于烟叶表面，蛋白质降低了20.00%。但目前为止，利用微生物发酵法降解烟叶蛋白依然存在蛋白酶活性不高，蛋白降解率偏低等问题，难以在工业生产中推广应用。

为获得能够高效降解烟叶蛋白质的菌株，提高烟叶品质，本研究从不同年份、不同等级复烤烟叶表面筛选出一株蛋白酶高产菌株，并对其进行鉴定及应用效果探索，以期为高蛋白含量烟叶在卷烟中的应用提供新的选择。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 烟叶

用于菌株筛选的烟叶：采自河南(许昌和三门峡)、福建(三明和南平)以及云南(楚雄和临沧)6个产地，3个年份(2011～2013年)的复烤烟叶，共计18份；

供试烟叶(作用效果考察用)：河南许昌C3F。

1.1.2 主要试剂

酪素、牛血清白蛋白：分析纯，美国Fluka公司;

马铃薯、玉米浆、豆粕：市售;

其他试剂：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

营养琼脂(NA)培养基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠 5 g，去离子水定容至1 000 mL，pH 7.0，固体培养基加15 g 琼脂粉，121 ℃灭菌20 min，用于细菌的分离与培养；

YEPD培养基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，去离子水定容至1 000 mL，pH 7.0，固体培养基加入15 g琼脂粉，121 ℃灭菌20 min，用于酵母的分离和培养；

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉12 g，去离子水定容至1 000 mL，固体培养基加15 g琼脂粉，121 ℃灭菌20 min，用于烟叶表面真菌的分离与筛选；

初筛培养基：KH2PO40.36 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，ZnCl20.014 g，Na2HPO4·12H2O 1.07 g，NaCl 0.16 g，CaCl2·H2O 0.002 g，FeSO4·7H2O 0.002 g，脱脂奶粉10.0 g，琼脂15 g，去离子水定容至1 000 mL，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min；

复筛培养基：玉米浆15.0 g，豆粕15 g，蛋白胨1.0 g，NH4Cl 5.0 g，KH2PO41.0 g，Na2HPO45.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO40.1 g，pH 7.0，去离子水定容至1 000 mL，121 ℃ 灭菌20 min。

1.1.4 主要仪器

分光光度计：WFJ2100型，尤尼柯(上海)仪器有限公司；

冷冻离心机：Sigma2-16K型，德国Sigma公司；

PCR仪：Mastercycler nexus X型，德国Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 烟叶中微生物的初步分离 称取0.5 g烟叶粉末，加入含有4.5 mL无菌水的10 mL灭菌试管中，于摇床200 r/min 水平震荡15 min，然后竖直静置5 min。用移液枪吸取上清菌悬液1 mL于含有9 mL无菌水的灭菌10 mL试管中，依次稀释为10-2和10-3的菌悬液；分别吸取10-2、10-3稀释度的菌悬液100 μL，涂布于NA和PDA培养基平板，分别于37，28 ℃培养过夜。

观察菌落大小、形态特征，对不同菌落进行编号，记录菌落特征及长势。

1.2.2 产蛋白质降解菌筛选 将上述分离获得的细菌、真菌依次接种到蛋白质降解菌选择培养基上，细菌在37 ℃培养，真菌在30 ℃培养。观察并计算透明圈直径与菌落直径的比值和透明圈明显程度，通过统计学分析选择出酶活较高的菌株。

将能够在蛋白质降解菌选择培养基上产生透明圈的菌株，按菌株种类的不同接种到NA或YEPD培养基，37 ℃或30 ℃下150 r/min震荡培养12 h，按照2%的接种量接入50 mL 产蛋白酶发酵培养基的锥形瓶中，37 ℃下150 r/min发酵48 h。取发酵液于3 500 r/min离心10 min后取上清液，测酶活。

1.2.3 蛋白质降解菌的蛋白酶活性测定 采用福林酚法[11]，以2%的酪蛋白溶液为底物。

1.2.4 烟叶蛋白含量的测定 采用Brad-Ford法[12]，以牛血清白蛋白为标准。

1.2.5 蛋白质降解菌的16S rDNA分析 菌株总DNA的提取，采用改良的SDS方法进行提取。PCR扩增采用通用引物，得到的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测合格后送至上海铂尚生物技术有限公司进行测序，测序结果在NCBI数据库中利用BLAST进行序列分析。

下载同源性较高菌株的16S rDNA序列，与测得序列通过DNAMAN软件进行序列比对分析。

1.2.6 烟叶中蛋白质降解菌的形态学与理化鉴定 在NA固体培养基上，37 ℃培养48 h后，观察菌落外部形态特征；使用显微镜油镜观察细菌形态[13]。

参照文献[14]对蛋白酶产生菌HN-3进行革兰氏染色、接触酶反应、V-P反应、酪素水解反应等试验。

1.2.7 菌株降解烟叶蛋白质的应用 将保藏的HN-3菌株转接到NA培养基内，于37 ℃、150 r/min震荡培养24 h，至菌悬液OD值为2.0时，3 600 r/min离心10 min，弃上清，加入等体积的无菌生理盐水，得到种子液。

取100 g许昌复烤烟叶，选择发酵时间、施加菌液量、发酵温度为影响因素，通过单因素试验确定了各因素的水平范围，并设计三因素三水平正交试验，优化菌株有效降解烟叶蛋白质的适宜条件[15]。正交试验因素和水平见表1。

将烟叶切丝，制成烟支规格(20+64) mm×24.5 mm的烟支样品，在22 ℃、相对湿度60%的恒温恒湿箱中平衡48 h后待评。由11名专业评吸员按9分制打分，汇总结果去除最高分和最低分后取平均值。

2 结果与分析

2.1 蛋白质降解菌的初筛

从不同类型复烤烟叶样品中，经菌落大小、颜色、形态分析，共分离获得细菌123株，真菌9株。这些细菌、真菌经蛋白质降解菌选择培养基筛选，获得能够产生透明圈的菌株18株。

18株菌株在蛋白质降解菌选择培养基上生长48，72 h之后产生的透明圈分别见图1、2。

进一步测定18株菌株在蛋白质降解菌选择培养基上生长48，72 h之后透明圈/菌落直径比值的平均值，并通过均值方差分析法分析差异显著性，结果见表2。

† 99% 整体置信区间，分组中不共享字母的均值之间具有显著差异；*表示由于该菌落形态极不规则，无法计算直径，或长度无法计算，或透明圈与菌落直径比值无法计算。

方差分析结果表明，48 h和72 h的透明圈菌落直径比中，HN-3、YN-6和YN-10的比值较大，差异性分组均不共享字母，差异性显著。HN-4的48 h比值差异不显著，考虑到72 h的结果差异显著以及透明圈较大，列为待考察菌株。YN-13和FJ-18菌落形态不规则，但实际观察中透明圈较大，因此同样列为待考察菌株。

2.2 烟叶中蛋白质降解菌的复筛

将6个菌株接种于产蛋白酶培养基上，30 ℃下150 r/min振荡培养48 h后，经测定OD660并计算，结果见图3。其中，HN-3具有最高的蛋白酶活力(3 417 U/mL)，因此选择为试验菌株，应用于烟叶蛋白的降解。

2.3 菌株的16S rDNA序列测定

采用16S rDNA基因片段通用引物FP/RP，对HN-3进行PCR扩增以及克隆测序，获得一条1 422 bp的片段，将测序结果与NCBI数据库中的基因序列进行比对，发现HN-3与短小芽孢杆菌的同源性高达100%，确定HN-3是短小芽孢杆菌。使用DNAMAN软件，选取同源性较高的7种模式细菌菌株，进行系统进化分析，显示HN-3与短小芽孢杆菌的亲缘关系最近(图4)。

2.4 HN-3的形态学观察

在37 ℃培养48 h后，HN-3菌落呈白色至淡黄色，表面无光泽，不透明，表面不平整，凸起，菌落近圆形或不规则，菌落边缘不规则，在蛋白质降解菌选择培养基上生长速度较快。菌株个体0.6～0.7 μm×2.0～3.0 μm，呈杆状(图5)，很少呈链状，芽孢椭圆形。

2.5 HN-3的理化鉴定

HN-3经试验分析，发现该菌革兰氏染色呈阳性，甲基红反应呈阴性，接触酶反应呈阳性，V-P测验呈阳性，产酸反应呈阳性，在7% NaCl中不能生长，酪素水解反应呈阳性，淀粉水解反应呈阳性，硝酸盐还原试验呈阴性，最低生长温度10 ℃，最高生长温度50 ℃(表3)。参考《伯杰细菌鉴定手册》[16]，确定HN-3为短小芽孢杆菌。

2.6 HN-3降解烟叶中蛋白质的效果

测得对照烟叶的蛋白质含量为112.47 mg/g。由表4可知，最优水平组合为A3B1C2，即时间为84 h、菌液施加比例为3%、发酵温度为37 ℃；菌液施加比例对整个作用条件的影响最大，其次是发酵温度，而发酵时间的影响最小。

由于最优化组合A3B1C2并不在9组正交处理方案中，因此对优化处理方案进行了验证实验。结果表明，将菌液按照3%的烟叶质量比例施加于抽梗后的烟叶表面，在温度为37 ℃的条件下发酵84 h后，烟叶中蛋白质降解率可达最高值(29.66%)。

2.7 HN-3处理烟叶后感官评吸效果

进一步对菌液处理前后的烟叶进行感官质量评价，结果见表5。

由表5可知，烟叶经过菌液处理后，香气质变好，香气量、烟气浓度有所提高，杂气减少，余味有所改善，与对照相比，总得分提高1.13分，烟叶整体感官质量得到明显提升。

†T=(A+B)×2.3+C×1.5+D+E+F+G。

3 结论

本研究从不同类型复烤烟叶样品中分离出18株蛋白质降解菌株，观察其在蛋白质降解菌选择培养基上生长48 h和72 h降解蛋白质的情况可知，HN-3、HN-4、YN-6、YN-10、YN-13、FJ-18降解蛋白的能力较强。进一步测定菌株蛋白质酶活力表明，6种菌株的蛋白酶活性分别为3 417，2 217，3 246，2 789，2 217，3 017 U/mL，蛋白酶活力最高的菌株是在蛋白质降解菌选择培养基上生长快且透明圈与菌落直径比值较大的HN-3。

通过16Sr DNA测序，HN-3与短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)的同源性高达100%，亲缘关系最近，结合形态学与理化特性，参考《伯杰细菌鉴定手册》，确定HN-3为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。在之前的研究中，黄静文等[17]从烤烟表面分离到1株短小芽孢杆菌Van35，将其制成菌液施用于卷烟烟丝，22 ℃于60%恒温恒湿箱发酵20 d，结果表明，烟叶纤维素含量、总氮均明显降低，短小芽孢杆菌处理后的烟叶，烟香、细腻醇均明显提升，烟叶刺激性、杂气均明显下降，但未报道短小芽孢杆菌Van35是否具有降解烟叶中蛋白质的功能。本研究将由HN-3制成的菌液喷施于烟叶表面，烟叶中蛋白质降解率可达29.66%，证明短小芽孢杆菌HN-3能有效降解烟叶中的蛋白质，且能显著改善烟叶的整体感官质量。综合之前研究可推测短小芽孢杆菌可有效降解烟叶中蛋白质、纤维素等大分子物质，减少这些大分子物质在烟叶燃吸时产生的刺激气体等，从而有效改善烟叶的吸食品质，相关结果有待进一步验证。

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