玉米黄色素提取工艺优化及其抗癌活性研究

于 慧 刘美佳 刘剑利 曹向宇

(辽宁大学生命科学院，辽宁 沈阳 110036)

玉米黄色素提取工艺优化及其抗癌活性研究

于 慧 刘美佳 刘剑利 曹向宇

(辽宁大学生命科学院，辽宁 沈阳 110036)

探究超声辅助酶法制备玉米黄色素的最佳工艺，以及玉米黄色素对人胃腺癌细胞(BGC-823)生长的抑制作用。通过单因素和响应面试验，探讨超声辅助酶法制备玉米黄色素的最佳条件；用制备的玉米黄色素处理BGC-823细胞，并进行形态学观察和MTT法细胞存活率检测，初步考察其抗癌活性。超声辅助酶法提取玉米黄色素的最佳条件为：酶活力10 000 U/g，超声功率400 W，酶解温度35 ℃，该条件下提取率达最大，为(72.64±0.42) μg/g；细胞形态学观察及MTT细胞活力检测显示玉米黄色素对BGC-823细胞具有一定的生长抑制作用。超声辅助酶法提取玉米黄色素是一种有效的提取方法，制备的玉米黄色素对BGC-823细胞生长有较强的抑制作用。

玉米黄色素；超声波；酶法；抗癌

玉米(ZeamaysL.)是禾本科玉米属一年生草本植物，具有种植面积广，产量大的特点。《国家粮食安全中长期发展规划(2008～2020)年》制定的粮食增产目标中，玉米份额达到53%[1]。近年来，玉米的应用日益广泛。在营养方面，玉米能量利用率较高。玉米中除了脂溶性维生素E和叶黄素含量较高，还含有谷胱甘肽，具有延缓衰老、增强免疫力等功能。在药用方面，玉米具有降压、降糖、防止动脉硬化、预防肿瘤之功效[2]。因此，玉米的研究与开发成为国内外研究热点，越来越受到人们的关注。

玉米黄色素(Corn Color)是一种可以从玉米中提取的几种类胡萝卜素的含氧衍生物的混合物，主要由玉米黄素、黄体素、隐黄素和β-胡萝卜素组成[3]，可广泛应用于医药、食品、包装等行业[4]。玉米黄色素属异戊二烯类色素，具有重要的生理功能，例如抑制肿瘤的增长，预防心脑血管疾病，增强人体免疫力和预防老年性视黄斑变性等[5]。因而开发和利用玉米中营养素——玉米黄色素具有重要的研究意义和经济价值。目前，对玉米黄色素的研究多集中于玉米黄色素的提取[6]、纯化[7]、稳定性[8]，而对其抗癌活性[9]、抗氧化活性[10]研究较少，且抗癌活性主要集中在乳腺癌[9]、卵巢癌研究[11]上。本试验以BGC-823细胞为试验研究对象，考察其抗胃癌活性，以期为人类健康和疾病预防提供一种明确生物活性的天然物质。

传统玉米黄色素的提取为有机溶剂浸提法，出于溶剂的安全性考虑，玉米黄色素的提取溶剂多选取乙醇，并辅以其它提取方法，以缩短提取时间并使提取更加充分[6]。超声波借助机械振动，改变物质内部结构、状态、功能或加速这些过程，从而增加溶剂对细胞壁的穿透力，强化浸提过程，缩短浸提时间，已被广泛用于植物有效成分的提取。碱性蛋白酶可有效降解蛋白质，释放玉米黄色素，提高玉米黄色素的有效溶出率[12]。本研究拟采用超声辅助酶法从玉米中提取玉米黄色素，采用响应面法对提取工艺进行优化，并在细胞水平上研究玉米黄色素对人胃腺癌细胞(BGC-823)的影响，以期为玉米黄色素的利用和抗癌功能开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米：华农101，市售；

人胃腺癌细胞：BGC-823，中国医科大学盛京医院提供；

β-胡萝卜素：标准品，纯度≥98%，国药集团化学试剂有限公司；

碱性蛋白酶：酶活力200 000 U/g，国药集团化学试剂有限公司；

3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)：纯度≥98%，美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

电子分析天平：BS223S型，北京赛多利斯仪器系统有限公司；

高速冷冻离心机：JW-3021HR型，安徽嘉文仪器装备有限公司；

荧光倒置显微镜：OLYMPUS DP73型，普赫光电(上海)科技有限公司；

可见光分光光度计：721N型，上海精密科学仪器有限公司；

冷冻干燥机：CHRIST型，北京鑫盛鸿阳科技有限公司；

旋转蒸发仪：RE-52CS-2型，上海虹昕电子仪器仪表有限公司；

全自动酶标仪：Sunrise型，瑞士帝肯公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米黄色素的提取 玉米黄色素的提取方法参照朱洪梅[10]，略有改动。玉米预处理，洗净，脱粒并粉碎，过120目筛备用。采用两步法提取玉米黄色素，取过筛后的玉米粉，加入碱性蛋白酶进行酶法提取，之后加入无水乙醇进行超声提取。浸提液4 000 r/min离心5 min，取上清液通过三层纱布过滤，用旋转蒸发仪对滤液进行浓缩，冷冻干燥得到粉末，具体工艺：

玉米→脱粒→颗粒粉碎→加酶水解→水浴→加乙醇→超声→离心→取上清→过滤→浓缩→冷冻干燥

1.3.2 β-胡萝卜素标准曲线的测定 根据文献[13]，修改如下：以无水乙醇为溶剂准确称取β-胡萝卜素5.00 mg，定容至50 mL，然后分别取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL的溶液定容至10 mL，再将以上溶液分别稀释10倍，在446 nm处测吸光值。空白对照组选取无水乙醇，绘制标准曲线，得到β-胡萝卜素标准回归方程。

1.3.3 单因素试验设计 对多个单因素进行预试验，最终选取结果影响较大的3个因素，即：酶活力、酶解温度、超声功率，进行单因素试验研究。

(1) 酶活力对玉米黄色素提取率的影响：称取2.0 g玉米粉末，加入碱性蛋白酶，酶活力分别为4 000，8 000，12 000，16 000，20 000 U/g，加入40 mL蒸馏水，酶解时间4 h，酶解温度30 ℃，之后加入60 mL 无水乙醇，超声20 min，超声功率200 W。浸提液4 000 r/min离心5 min，上清液在446 nm下测吸光度，每组试验做3个平行。

(2) 酶解温度对玉米黄色素提取率的影响：称取2.0 g玉米粉末，加入碱性蛋白酶，酶活力12 000 U/g，加入40 mL蒸馏水，酶解时间4 h，酶解温度分别为：20，30，40，50，60 ℃，之后加入60 mL 无水乙醇，超声20 min，超声功率200 W。浸提液4 000 r/min离心5 min，上清液在446 nm下测吸光度，每组试验做3个平行。

(3) 超声功率对玉米黄色素提取率的影响：称取2.0 g玉米粉末，加入碱性蛋白酶，酶活力12 000 U/g，加入40 mL蒸馏水，酶解时间4 h，酶解温度40 ℃，之后加入60 mL 无水乙醇，超声20 min，超声功率分别为：100，200，300，400，500 W。浸提液4 000 r/min离心5 min，上清液在446 nm下测吸光度，每组试验做3个平行。

1.3.4 Box-Behnken试验设计 应用Design-Expert 8.0.6软件，采用Box-Behnken设计，以玉米黄色素提取率为响应值，对主要单因素(酶活力、超声功率、酶解温度)进行优化，选取3因素3水平的旋转组合设计，从中筛选提取玉米黄色素的最佳工艺条件。

1.3.5 玉米黄色素抗癌活性的测定

(1) 玉米黄色素对人胃腺癌细胞损伤的形态学观察：根据文献[14]，修改如下：将823细胞以每孔4×105个接种到6孔板内，每孔培养液体积2 mL，置于37 ℃ 5%的CO2培养箱中培养24 h，然后设置空白组，试验组(玉米黄色素浓度0.25，0.50，1.00 mg/mL)，共同培养24 h，在显微镜下观察细胞形态。

(2) 玉米黄色素对人胃腺癌细胞增值情况的影响：根据文献[15]，修改如下：将823细胞以每孔3×103个接种到96孔板内，每孔培养液体积200 μL，培养24 h后，设置空白组，试验组(玉米黄色素浓度0.25，0.50，1.00 mg/mL)，继续培养24 h，MTT法检测细胞活力。

1.3.6 数据分析 试验重复3 次，结果取平均值，采用SPSS 19.0 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

在280～600 nm波长范围内对β-胡萝卜素进行全波扫描，在446 nm处发现β-胡萝卜素最大波峰，因此本试验中玉米黄色素的含量计算以446 nm下吸光值为准。在一定浓度范围内，β-胡萝卜素的含量与其在446 nm处的吸光度值呈良好的线性关系(R2=0.999 6)，见图1。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 酶活力对玉米黄色素提取率的影响 由图2可知，在一定范围内，随酶活力的增加，玉米黄色素提取率也随之提高，但当酶活力达到12 000 U/g时，玉米黄色素提取量达到最大值，之后随酶活力的增加，玉米黄色素提取率呈下降趋势。原因是当酶活力较低时，底物没有被完全酶解，随着酶活力的增加，玉米黄色素被逐渐释放，但当酶活力大于12 000 U/g时，酶解反应达到饱和，所以提取率不再升高[16]。可见最佳酶活力为12 000 U/g时，此条件下，玉米黄色素提取率为(64.780±1.285) μg/g。

2.2.2 酶解温度对玉米黄色素提取率的影响 由图3可知，一定温度范围内，玉米黄色素提取率随温度升高呈现先增加后减少的趋势，当温度达到40 ℃时，提取率达到最大值，为(65.69±1.21) μg/g，当温度在40 ℃以上时，呈下降趋势。因此玉米黄色素提取的最佳温度为40 ℃。

2.2.3 超声功率对玉米黄色素提取率的影响 由图4可知，一定范围内，随超声功率的增加，玉米黄色素提取率逐渐提高，当超声功率达到400 W时，玉米黄色素提取率达最大值，之后随超声功率的提高，玉米黄色素提取率不再升高，功率过大会增加能耗，从节能角度考虑，选取最佳超声功率为400 W，此条件下，玉米黄色素提取率为(65.99±0.48) μg/g。

2.3 响应面试验结果

以单因素结果为依据，细化因素水平，根据Box-Behnken试验设计原理得到响应面因素设计水平，见表1。

根据试验设计得到的试验结果见表2。

2.4 回归模型方差分析

利用软件设计Design-Expert 8.0.6 对数据进行多元回归拟合，获得酶活力、超声功率、酶解温度的二元多项回归方程：

Y=68.0-4.70A+1.28B-1.18C-0.91AB-0.37AC+0.49BC-1.14A2-3.01B2+0.22C2。

(1)

由表3可知，模型P<0.000 1，模型显著，失拟项P=0.422 3，失拟项不显著，另外酶活力的一次项，超声功率的一次项，酶解温度的一次项，酶活力与超声功率的交互项，酶活力与酶解温度的交互项，超声功率与酶解温度的交互项，酶活力的二次项，超声功率的二次项均达到极显著水平(P<0.01)；酶解温度的二次项达到显著水平(P<0.05)。由F值可以看出各因素影响结果的主次顺序是A>B>C。模型R2=0.999 2，表明模型与实际拟合程度好，模型能够解释大多数因变量的变化。综上，模型成立，拟合程度较好，试验误差较小。

2.5 各因素交互作用的响应面分析

由图5(a)可知，当酶活力一定时，提取率随超声功率的增加，呈现先升高后降低的变化趋势；当超声功率一定时，随酶活力增加提取率呈下降趋势。响应曲面的坡度陡峭，表明响应值对酶活力和超声功率比较敏感，等高线的疏密程度可知，酶活力和超声功率的交互作用明显，影响显著。最优点十分接近酶活力1 000 U/g和超声功率400 W，并且在这个点提取率有最大值。由图5(b)可知，当酶活力一定，提取率随酶解温度的升高逐渐升高；当酶解温度一定时，提取率随酶活力的增加逐渐下降。从等高线可看出，两因素的交互作用较强，影响显著，相比于酶解温度，提取率对酶活力更为敏感。由图5(c)可知，当超声功率一定时，随酶解温度的升高，提取率逐渐增加；当酶解温度一定时，随着超声功率的增加，提取率呈先升高后下降的趋势。响应曲面的坡度较为陡峭，可知响应值对超声功率和酶解温度比较敏感；由等高线疏密程度可知，超声功率和酶解温度的交互作用较显著。最优点接近于超声功率400 W和酶解温度35 ℃，并且在该点提取率有最大值。

† ** 表示差异极显著(P<0.01)；*表示差异显著(P<0.05)。

Figure 5 Response surface and contour plots for the effects of interaction between enzyme activity and ultrasonic power, between enzyme activity and enzyme solution temperature, between ultrasonic power and enzyme solution temperature on the yield of extraction ratio

2.6 验证实验结果

通过Design-Expert 8.0.6软件设计，得玉米黄色素提取最佳工艺参数为酶活力10 000 U/g，超声功率413.99 W，酶解温度35 ℃，此条件下玉米黄色素理论提取率为72.90 μg/g。考虑到实际操作中遇到问题，将提取工艺修整为：酶活力10 000 U/g，超声功率400 W，酶解温度35 ℃，对优化参数进行3次重复实验得玉米黄色素提取率为(72.64±0.42)μg/g。预测值与实验值非常接近，进一步证明试验设计和数学模型具有可靠性和重现性。

2.7 玉米黄色素对人胃癌细胞损伤的形态学观察结果

由图6、7可知，空白对照组细胞贴壁状态良好，棱角清晰。随玉米黄色素试验组剂量的增加，细胞贴壁数目逐渐减少，其中1.00 mg/mL玉米黄色素组细胞明显变圆收缩，贴壁数目是空白组的47.2%，与空白组相比，差异极显著(P<0.01)，说明玉米黄色素对人胃癌细胞具有抑制作用，并且呈现剂量—效应关系。陆雪莹等[17]选取木犀草素处理BGC-823细胞，凋亡细胞表现为细胞间隙增大，体积缩小，细胞边缘模糊，细胞折光性减弱，与玉米黄色素处理组细胞形态相似。

2.8 玉米黄色素对人胃癌细胞增值情况的影响

由图8可知，玉米黄色素能够有效抑制823细胞的生长，当加入1.00 mg/mL玉米黄色素，细胞存活率变为22.1%，与空白组比较差异极显著，并且随玉米黄色素剂量的升高，对细胞抑制效果增强，呈现剂量效应关系。李晓伶等[9]研究表明，当玉米黄色素浓度为53.21 μg/mL时，人卵巢透明癌(ES-2)细胞抑制率达到50%，当玉米黄色素为62.21，61.93，98.60 μg/mL时，对人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人肺癌细胞(A549)、前列腺癌细胞(PC-3)也具有同样的抑制效果。宋佳等[18]试验结果表明，酒糟中玉米黄色素对宫颈癌(Hela)细胞也具有抑制作用，当浓度20 μg/mL时，抑制率达到31.98%。可见玉米黄色素具有抑制癌细胞增值的作用，但对不同癌细胞的抑制情况不同。

**与空白组相比差异极显著，P<0.01；*与空白组相比差异显著，P<0.05

图8 玉米黄色素对人胃癌823细胞存活率的影响

Figure 8 Effect of maize yellow pigment on viability of 823 cells

3 结论

本试验通过对酶活力、超声功率、酶解温度3个因素的探究，建立了影响玉米黄色素得率的二次多项数学模型，优化得出玉米黄色素超声辅助酶法提取的最佳工艺条件为：酶活力10 000 U/g，超声功率400 W，酶解温度35 ℃；最佳条件下的得率为(72.64±0.42) μg/g。通过形态学观察及MTT细胞活力检测表明玉米黄色素对人胃癌细胞具有一定损伤作用。通过试验表明超声辅助酶法制备玉米黄色素是一种有效的方法，制备的玉米黄色素具有一定抗癌活性，但其确切抗胃癌机制还有待进一步研究。

[1] 赵锦. 气候变化背景下我国玉米产量潜力及提升空间研究[D]. 北京: 中国农业大学, 2015: 1-8.

[2] SITTHITRAI K, KETTHAISONG D, LERTRAT K, et al. Bioactive, antioxidant and enzyme activity changes in frozen, cooked, mini, super-sweet corn (Zea mays L. saccharata ‘Naulthong’)[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2015, 44(12): 1-9.

[3] NWACHUKWU I D, UDENIGWE C C , ALUKO R E, et al. Lutein and zeaxanthin: Production technology, bioavailability, mechanisms of action, visual function, and health claim status[J]. Trends in Food Science & Technology, 2016, 49(3): 74-84.

[4] PRADO-CABRERO A, BEATTY S, STACK J, et al. Quantification of zeaxanthin stereoisomers and lutein in trout flesh using chiral high-performance liquid chromatography-diode array detection[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2016, 50(7): 19-22.

[5] 袁晓晴, 刘红梅, 王德静, 等. 超声波辅助乙醇提取玉米黄色素的工艺研究[J]. 中国食品添加剂, 2015(5): 132-136.

[6] 周芳, 郝红英. 玉米黄色素提取工艺研究进展[J]. 广东化工, 2014, 41(21): 105-106.

[7] 李晓玲, 王世清, 王文亮, 等. 大孔树脂纯化脂溶性玉米黄色素[J]. 中国食品学报, 2014, 14(9): 164-169.

[8] 黄新辉, 李跟深, 马淑惠, 等. 玉米黄色素的稳定性研究[J]. 化学与生物工程, 2006, 23(6): 38-40.

[9] 李晓玲, 王世清, 徐同成, 等. 玉米黄色素对人卵巢透明癌细胞 ES-2 侵袭、迁移、凋亡及周期的影响[J]. 现代食品科技, 2014, 30(2): 1-5.

[10] 朱洪梅. 玉米黄色素提取工艺及其抗氧化活性研究[J]. 中国粮油学报, 2010, 25(7): 15-20.

[11] 孙震, 苏宇杰, 姚惠源. 玉米蛋白粉中黄体素、玉米黄素对乳腺癌细胞增殖的影响[J]. 食品与机械, 2005, 21(2): 6-11.

[12] 刘军海, 王俊宏, 代红灵. 玉米黄色素提取工艺的研究进展[J]. 食品研究与开发, 2013, 34(11): 109-111.

[13] 李晓玲, 陈相艳, 王文亮, 等. 超微粉碎与微波辅助酶法提取玉米黄色素工艺优化[J]. 食品科技, 2014, 39(2): 228-233.

[14] 刘剑利, 刘晓, 曹向宇, 等. 稠李花色苷的纯化及体外抗氧化活性[J]. 食品科学, 2015, 36(15): 5-10.

[15] 刘晓, 曹向宇, 李其久, 等. 稠李花色苷酶法制备及对H2O2诱导大鼠胰岛素瘤细胞损伤的保护作用[J]. 食品科学, 2016, 37(6): 7-12.

[16] 李孚杰, 潘丹贞, 张丛兰, 等. 纤维素酶法提取板栗壳色素的工艺条件优化[J]. 食品科学, 2012, 33(2): 149-153.

[17] 陆雪莹, 李艳红, 肖向文, 等. 木犀草素抑制人胃癌BGC-823细胞增殖作用的研究[J]. 现代中西医结合杂志, 2012, 21(3): 246-249.

[18] 宋佳, 姜福佳, 田野, 等. 超声波法优化酒糟中玉米黄色素的提取工艺及其抗肿瘤的研究[J]. 酿酒, 2009, 36(2): 65-68.

Extraction process optimization and anticancer activity of maize yellow pigment

YU HuiLIUMei-jiaLIUJian-liCAOXiang-yu

(SchoolofLifeScience,LiaoningUniversity,Shenyang,Liaoning110036,China)

Objective: To study the best preparation technology of maize yellow pigment by ultrasonic assisted with enzymatic method, and the inhibitory effect of them on the growth of human gastric cancer cells (BGC-823). Methods: The optimum conditions of maize yellow pigment were extracted by ultrasonic assisted with enzymatic method by single factor and response surface experiments. The inhibition of maize yellow pigment on BGC-823 cells was detected by morphological observation and MTT assay to evaluate the antitumor activity. Results: the maize yellow pigment best extraction condition of ultrasonic with enzymatic method is: enzyme activity 10 000 U/g, ultrasonic power 400 W, enzymolysis temperature 35 ℃, the maximum extraction yield was (72.64 ± 0.42) μg/g under the condition, the maize yellow pigment has a certain inhibitory effect on BGC-823 cell were studied by cell morphological observation and MTT test. Conclusion: The extraction of maize yellow pigment by ultrasonic assisted with enzymatic method is a kind of effective extraction method, the maize yellow pigment prepared has strong inhibitory effect on BGC-823 cells.

maize yellow pigment; ultrasonic; enzymic method; anticancer

国家自然科学基金委员会科学部主任基金项目(编号：31240005)；辽宁省农业领域青年科技创新人才培养资助计划项目(编号：2015013)；辽宁省高等学校优秀人才支持计划项目(编号：LJQ2013002)；辽宁省高等学校科学研究一般项目(编号：L2014007)；辽宁大学博士科研启动项目

于慧，女，辽宁大学在读硕士研究生。

曹向宇(1980—)，男，辽宁大学教授，博士。 E-mail：xycaolnu@163.com

2016—12—15

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.029