浓香型白酒糟醅中农药降解菌的筛选及多样性分析

冯瑞章周万海 游 玲 魏 琴 舒 媛

(1. 宜宾学院生命科学与食品工程学院学院，四川 宜宾 644000；2. 固态发酵资源利用四川省重点实验，四川 宜宾 644000)

浓香型白酒糟醅中农药降解菌的筛选及多样性分析

冯瑞章1,2周万海 游 玲 魏 琴 舒 媛

(1. 宜宾学院生命科学与食品工程学院学院，四川 宜宾 644000；2. 固态发酵资源利用四川省重点实验，四川 宜宾 644000)

通过富集培养和平板初筛，从浓香型白酒糟醅中分离筛选可降解农药的微生物菌株，并进行16S rRNA 基因序列系统发育分析。结果显示：52株分离菌株中，可降解丙环唑、莠去津和2,4D丁酯的菌株分别为25，10，17株，其中51株菌分属于Bacillus、Lysinibacillus、Pseudomonas、Acinetobacter、Brevibacillus和Stenotrophomonas6个属的22个模式菌株，1株菌与B.thuringiensis的序列相似度为97.3%，可能是该菌株的变种；Bacillus是可以降解3种农药的共有属和优势属(37株，占总菌数的71.2%)，Stenotrophomonas和Brevibacillus分别为降解莠去津和2,4D丁酯的特有属。

白酒糟醅；农药降解菌；筛选；多样性

农药残留是农药吸附、降解、迁移等多种因素综合作用的结果，其中降解是制约残留量的关键因子[1]。为了降低农药对食品和环境的影响，科学家们早就开始了农药降解行为的研究，张宁[2]2006年报道臭氧可降解蔬菜中多种农药的残留。研究[3]表明，因微生物对农药的降解具有反应条件温和、反应速度快和反应专一性强等特点，对环境中的农药降解起着关键作用。近年来，研究人员[4]已从自然界的土壤或污水中筛选出包括细菌、真菌、放线菌、藻类等可降解各类农药的菌群；亦有研究[5]表明，农产品的发酵可有效降低或消除农药残留，表现出潜在降解农药的作用。以固态发酵为典型特征的浓香型白酒，其酿造过程中复杂的微生物群落对产品的质量和酒体风格有至关重要的作用，目前关于浓香型白酒微生物的研究主要涉及微生物群落组成及变化、功能微生物在提高产量方面的应用，但对于农药降解微生物的研究未见报到。

本研究拟选用小麦、玉米、高粱等浓香型白酒生产原料种植中广泛使用的莠去津、丙环唑和2,4D丁酯农药，通过糟醅喷药、诱发降解菌、采集糟醅进行农药降解菌的分离和筛选，并对其发育多样性和农药降解能力进行研究，旨在为中国白酒生产过程的安全监控和风险预测提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 糟醅和药剂

糟醅：采自宜宾规模以上浓香型白酒生产企业；

莠去津(99%)、丙环唑(98%)、2,4D丁酯(95%)：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 培养基

基础培养基：K2HPO42.4 g/L，KH2PO41.2 g/L，NH4NO31 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl2·2H2O 0.025 g/L, Fe2(SO4)30.008 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH 值7.0～7.2；

富集培养基：基础培养基中添加一定浓度的农药；

纯化培养基：蛋白胨5 g/L，胰蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖10 g/L，MgSO4·7H2O 0.03 g/L，CaCl2·2H2O 0.003 g/L；蒸馏水1 000 mL，pH值7.0～7.2。

1.2 试验方法

1.2.1 富集培养 将50 mL富集培养基装入250 mL的三角瓶中，灭菌后加入丙环唑原药，使丙环唑含量为100 mg/L，加入糟醅样品10 g摇床培养7 d(30 ℃，160 r/min)，按体积比1∶10的接种量转接到含丙环唑浓度为200 mg/L的富集培养基，相同条件培养 7 d。连续转接5次，直至培养基中莠去津浓度为500 mg/L。相同的方法富集培养莠去津和2,4D丁酯降解菌株。

1.2.2 菌种分离纯化 取富集培养5次后的菌悬液0.2 mL，稀释至10-5，10-6，10-7，涂布于含有100 mg/L丙环唑的基础培养基平板上，28 ℃培养3～4 d。根据形态、色泽、大小特点挑取单个菌落接种至纯化培养基上28 ℃培养24 h，再将菌落划线培养，至单菌落生成。同法分离纯化莠去津和2,4D丁酯菌株，不同农药菌株分别编号。

1.2.3 农药降解菌的筛选 将纯化、编号后的菌株接种于含有100 mg/L丙环唑的固体基础培养基上，28 ℃培养2～3 d，转代培养于丙环唑含量为200 mg/L的培养基，继续转代3次，培养基中丙环唑浓度增至500 mg/L时还能生长良好的菌株，即为具有丙环唑降解潜能的菌株。同法筛选具有莠去津和2,4D丁酯降解潜能的菌株。

1.2.4 DNA提取与PCR扩增 参照文献[6]的方法提取各菌株的总DNA、扩增16S rRNA基因片段。引物27f：5-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3和 1541r：5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3。扩增产物由上海生物工程技术服务有限公司(Sangon)纯化测序(长度700～900 bp)，所有序列在GenBank注册。

1.2.5 系统发育分析 所得序列用EzTaxon Server 2.0[7]在线进行相似性分析。用ClustalX程序按照最大同源性的原则进行比对，采用 Kimura-2[8]计算序列相似值，并用BioEdit 5.0.9 进行检验；Mega 4.0软件进行系统进化树的构建、编辑与保存。

2 结果分析

2.1 农药降解菌的分离筛选

通过富集驯化，在3种含有供试农药的基础培养基上，共分离纯化得到132株细菌的纯培养物，其中可利用丙环唑、莠去津、2,4D丁酯的菌株分别为37，53，43株(表1)。 将上述菌株转代培养于农药浓度逐渐增加的固体平板培养基上，当莠去津、丙环唑和2,4D丁酯的浓度达到500 mg/L时，长势良好的菌株共52 株，其中，在丙环唑培养基上25 株、在莠去津培养基上有10株、2,4D丁酯培养基上17株，分别占初分离菌株数的18.9%，67.6%，39.5%。

2.2 系统发育分析

由图1可知，52 株供试细菌中，1株菌(菌株代号：XQB-33)的对应序列与Bacillusthuringiensis的相似性为97.3%，根据微生物16S rRNA 基因序列时相似度大于98%可认定为同一个种，相似度大于97%可认定为同一个属的理论[9-10]，可认定该菌株为B.thuringiensis菌株的变种或与其亲缘关系较近的其它种。除XQB-33菌株外，其余51 株菌与6个属的22个种的模式菌株对应序列相似度大于98%，其中37株菌属于Bacillus，占总供试菌株总数的71.2%，7株属于Lysinibacillus，3株属于Acinetobacter，2株属于Pseudomonas，2株分别属于Stenotrophomonas和Brevibacillus。以上结果表明浓香型白酒糟醅中可降解农药的微生物菌株表现一定的系统发育多样性，其中Bacillus是降解农药的主要和优势微生物。

2.3 降解不同农药菌株的种属分布

分析降解不同农药菌株的种属分布特征(表2)发现，能够降解丙环唑的25株细菌中，有22株分属于Bacillus的10个种，其中与模式种BacillusanthracisATCC 14578(T)的序列相似度大于98%的有12株，与B.oceanisediminisH2(T) 的序列相似度大于98%的有2株，与其它8个种相似度大于98%的菌株各有1株； 剩余2株与LysinibacillusmacroidesLMG 18474(T)属于同一微生物种群，1株与PseudomonasazotoformansIAM1603(T)的相似度大于98%。

能够降解莠去津的10菌株中，5株属于Bacillus的3个模式菌株，其中与B.anthracisATCC 14578(T)序列相似度大于98%有3株，1株与B.mycoidesATCC 6462(T) 序列相似度大于98%，1株与B.thuringiensisATCC 10792(T)的序列相似度为97.3%，可能是该模式种的一个变种或与其亲缘性很近的其它种；3株与Acinetobacter属的2个模式种的同源性大于98%，另外2株分别与Pseudomonas和Stenotrophomonas属的菌株同源性大于98%。

17株可降解2,4D丁酯的菌株中11株与Bacillus的6个模式菌株同源性超过98%，占到降解该农药总菌株数的64.7%，4株与LysinibacillusmacroidesLMG 18474(T)为同一菌株，另外2株分别与AcinetobacternosocomialisLMG 10619(T)和BrevibacillusparabrevisIFO 12334(T)为同一菌株。

以上结果表明，在宜宾白酒糟醅中，能够降解丙环唑的细菌有Bacillus、Lysinibacillus和Pseudomonas3个属，能够降解莠去津的细菌有Bacillus、Acinetobacter、Pseudomonas和Stenotrophomonas4个属，可以降解2,4D丁酯的菌株有Bacillus、Lysinibacillus、Acinetobacter和Brevibacillus4个属，其中Bacillus是可以降解3种农药的共有属，也是降解各种农药的优势属，Stenotrophomonas和Brevibacillus分别为降解莠去津和2,4D丁酯的特有属。

3 结论

微生物降解农药具有投入低、无毒、无残留、无二次污染的优势，治理效果也相对明显，是目前公认的低成本且环境友好型去除污染物的方法[11]。目前已经分离得到一批能降解或转化某种农药的细菌、真菌、放线菌等微生物，其中细菌因生化上的多种适应能力及易诱发突变菌株而占主要地位[12]。本试验通过富集培养，从宜宾浓香型白酒糟醅中分离筛选得到52株可降解农药的微生物菌株，系统发育分析发现，51株供试菌株与6个属22个种的模式菌株对应序列相似度大于98%， 1株菌与Bacillusthuringiensis的相似性为97.3%。Bacillus是可以降解丙环唑、莠去津和2,4D丁酯农药的共有属和优势属，Stenotrophomonas和Brevibacillus分别为降解莠去津和2，4D丁酯的特有属，优势种属及特有种属微生物的开发利用为中国白酒安全生产提供资源，也为后续继续研究农药降解菌及其酶活性的作用机制、有效应用现代生物技术改造或构建新的菌种提供资源。

† “-”代表没有菌株分配。

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Selection and diversity of pesticide-degrading bacteria isolated fromZaopeiof Luzhou-flavor Liquor

FENG Rui-zhang1,22ZHOUWan-hai21,2YOULing1,21,2WEIQing1,21SHUYuan1

(1.CollegeofLifeScienceandFoodEngineering,YibinUniversity,Yibin,Sichuan644000,China; 2.Solid-StateFermentationResourceUtilizationKeyLaboratoryofSichuanProvince,Yibin,Sichuan644000,China)

The pesticide-degrading bacteria was isolated and selected fromZaopeiof Luzhou-flavor Liquor by the enrichment culture and plate separation technology, then the phylogenetic analysis of these strains were carried out by 16S rRNA gene sequence. The results showed that 52 strains were isolated fromZaopeiof Luzhou-flavor Liquor, and 25 strains had degradative capability for Propiconazol, and 10, 17 had degradative capability for, Atrazine, 2,4-D butyl ester respectively. 51 strains belonged to 22 species of 6 genera (Bacillus,Lysinibacillus,Pseudomonas,Acinetobacter,Brevibacillus,Stenotrophomonas), and 1 isolatewaspresumed to be variety ofBacillusthuringiensis(with 97.3% sequence similarity).Bacilluswas the shared and dominant genus for, degradation three kinds of pesticides (Propiconazol, Atrazine, 2,4-D butyl ester) with 37 strains (accounting for 71.2% of 52 strains).StenotrophomonasandBrevibacilluswas the specific genera for Atrazine and 2,4-D butyl ester degradation respectively.

Zaopeiof Luzhou-flavor Liquor; pesticide-degrading bacteria; selection; diversity

四川省教育厅项目(编号：13ZA0201)；发酵资源与应用四川省高校重点实验室项目(编号：2010KFZ004，2011KFJ003)

冯瑞章，女，宜宾学院副教授，博士。

周万海(1979—)，男，宜宾学院副教授，博士。 E-mail:wanhaizhou@126.com。

2016—12—22

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.004