黑曲霉代谢组学研究进展*

靳梦琦 李 军 朱凤妹 刘 畅

1（河北科技师范学院食品科技学院，河北昌黎066600）

2（河北省果品加工工程技术研究中心，河北昌黎066600）

黑曲霉是一种广泛存在于自然界中的丝状子囊真菌，属于真核生物。黑曲霉的分生孢子头呈黑褐色放射状，顶囊呈球形，双层小梗，多见于粮食、植物性产品以及土壤中，生长的适宜pH值为3～7。黑曲霉是重要的工业发酵菌种，在有机酸发酵和工业酶制剂方面有着广泛的应用，同时在生物技术开展过程中发挥了很大的作用，很多产品来自于丝状真菌的初级和次级代谢产物。由于美国食品和药物管理局（FDA）已经认定许多来自黑曲霉的产物是安全的，所以黑曲霉被广泛用于食品级产物的生产过程中。

代谢组学是指对生物体内一切代谢物进行定性定量分析，它是关于生物体系内源代谢物质种类、数量及其变动规律的科学，研究生物整体、系统或器官的内源性代谢物质及其与内在或外在因素的相互作用，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系，其在系统生物学研究中占据着极其重要的地位。代谢组学研究的物质大多数为相对分子质量在1 000以内的小分子物质。代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后的系统生物学中另一个重要的组成部分，同时也是目前组学研究的热门研究领域之一。代谢组学研究与转录组学和蛋白质组学研究相比，具有易于检测、有数据库、通用性强、结果直接、数据准确等优点；与转录组学和蛋白质组学相比，通过代谢物分析能够更敏锐地分析环境扰动或胁迫对细胞的影响，因为在有些情况下环境的改变并不能影响细胞的转录水平和蛋白质水平，却可以通过其代谢产物的变化而表现出来。由于对黑曲霉基因组学、转录组学、蛋白质组学的研究越来越清晰，进一步推动了黑曲霉代谢组学研究的发展，可靠的胞内代谢物组数据的获取和代谢通量分析是揭示细胞真实代谢状态的直接证据，对于提高代谢工程和工业发酵过程优化的理论和实践水平也具有重要意义。本文对黑曲霉代谢组学研究方法及研究进展进行了概述，以期推进代谢组学在黑曲霉研究领域的应用。

1 黑曲霉代谢组学研究过程

作为新兴的分子生物学技术，代谢组学技术已被广泛应用在生物学的各个领域中。尤其在微生物领域中，该技术已取得了较大的进展。代谢组学技术应用高通量检测方法对微生物体内的代谢产物进行分析，并对其代谢产物的代谢途径进行研究整理。以Aspergillus和Penicillium为例，真菌细胞的次级代谢产物据估计达到10 000多种，但目前已知的代谢产物不足10%。本文以黑曲霉代谢组学研究为例，讲述代谢组学研究方法中的样品处理、代谢物分析鉴定和数据分析。

1.1 样品处理

黑曲霉代谢组学研究要求黑曲霉的生长条件是能够控制和重复的。必须严格控制温度、pH、培养基组成、溶解O2和CO2等，以明确界定生长条件，建立标准的和可重复的参考培育条件。黑曲霉菌丝球在培养过程中会受到多种因素的影响，例如pH、孢子浓度、营养成分、培养条件、黑曲霉的生长状态等。胡立明等人对黑曲霉产纤维素酶的液体发酵条件进行了研究，为进一步研究黑曲霉代谢组学提供了良好的培养基础。

在黑曲霉代谢组学研究中对取样的要求十分严格，要求快速取样，这样不仅能防止底物浓度发生巨大变化，而且还能保证黑曲霉的代谢产物维持稳定，为接下来的分析处理减少了影响。因此许多快速取样设备应运而生，如BioScope装置和Fast Swinnex Filtration（FSF）装置等，均可实现样品的快速采集。

与此同时，为了保证提取过程中代谢产物的完整性和真实性，要求在快速取样后迅速对样品进行淬灭以终止代谢反应。在淬灭过程中，要尽可能保证细胞的完整性并快速淬灭酶活力。液氮冷冻或高氯酸灭活技术是在动物和植物代谢组学研究中最为常用的2种灭活方法，但对于微生物的代谢组学研究，为了将胞内代谢物与胞外代谢物有效分离，则采用冷甲醇处理的淬灭方法，同时研究表明淬灭时用冷甲醇处理真核细胞的效果要好于处理原核细胞。目前这种方法在L.lactis、S.cerevisiae、E.coli、C.g lutam i2cum、A.niger、B.subtilis中均有应用。因此在丝状真菌黑曲霉的代谢物淬灭时运用冷甲醇处理的方法在目前较为适用。

代谢物的提取是黑曲霉代谢组学研究中最为重要的步骤之一。代谢物的提取程度直接影响试验的分析结果，因此在对代谢物进行提取时要求最大限度提取代谢物并且保证代谢物的完整性，不破坏或改变代谢物的相应理化性质。目前关于代谢物的提取溶剂有冷甲醇、热乙醇、高氯酸或碱、热甲醇、甲醇和氯仿混合液以及乙腈等。对于蛋白质应通过溶剂沉淀出来，如加入乙腈或甲醇使其变性；对于脂肪和脂质这类水不溶性的，可用2∶1的氯仿和甲醇混合液萃取得到。基于大量研究表明，出于对代谢物提取率的考虑，大多数提取方法采用热乙醇提取。

1.2 代谢物的分析鉴定

代谢物的检测、分析鉴定是代谢组学技术的重要组成部分。代谢物的分析平台主要分两类，分别是质谱（Mass Spectrometry，MS）和核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）技术分析平台。对于代谢产物的检测方法，一种新的多维分离技术如二级气相色谱飞行时间质谱的检测范围更为广泛，但由于其花费较大没能得到推广。对于气相质谱联用技术（GC-MS），此方法需要对挥发性较低的代谢物进行衍生化预处理，容易引起样品的变化且花费的时间较长。液相质谱联用（LC-MS）在检测过程中无需对样品进行预处理，这大大节省了检测时间，也使得其在黑曲霉代谢学研究中得到广泛应用。此外，毛细管HPLC-MS、UPLC-MS在微生物代谢组学研究中渐渐得到应用，明显提高了分辨率、灵敏度和通量。目前市场上出现的AbsoluteIDQTM p180试剂盒，可同时鉴定和定量180种代谢物，包括氨基酸、生物胺、酰基肉碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、鞘磷脂和己糖总和（一种产生的代谢物）等，可广泛用于代谢组学研究。AbsoluteIDQTMp180试剂盒通过与串联质谱联用的液相色谱（LC）分析氨基酸和生物胺，使用耦合到串联质谱法的流动注射（FIA）分析其他代谢物，采用新挑选的内标和多重化合物反应监测（MRM）进行鉴定和定量。例如，这种试剂盒用于人类代谢组的第一个大规模全基因组关联研究中鉴定和定量血清样品中的163种代谢物以及研究酒精诱导的代谢组学差异。因此，开发更广泛的标准化试剂盒对于定量代谢组学的进展是不可或缺的。

1.3 数据处理与分析

数据处理和数据分析是代谢组学研究的关键环节，需要对原始数据预先进行处理，消除相关干扰因素，从而得到代谢组学研究的可利用正确格式。代谢物组学分析从数据预处理开始，可根据质谱分析仪器所配套的软件进行谱峰提取、谱峰对齐、归一化和数据质量分析。对原始数据进行提取，以内标做参照，通过使用配套研发的专利软件，对质谱峰进行对齐，得出校正后的数据，然后运用统计学方法，计算每种化合物在不同样品组中差异的显著性。常见的分析方法以PCA分析、PLS-DA分析和OPLS-DA分析为主。在对代谢物进行分析时也要参照相关的代谢组学数据库，但就目前代谢组学相关研究数据来看，代谢组学数据库仍不完善，因此需要更多的科研工作者共同努力构建完整的代谢组学数据库。

2 代谢组学在黑曲霉领域的研究进展

近年来黑曲霉的代谢研究有显著的发展，结合基因组学、蛋白质组学对代谢组学有了进一步的了解。在工业微生物领域，对于代谢组学的研究主要集中在酵母菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等微生物上。近期对黑曲霉代谢组学的研究报道较多，由于黑曲霉有丰富的代谢产物，目前基因簇所发现的化合物仍然有限，因此对黑曲霉代谢产物组的研究可从中发现新的代谢化合物，并能提高对代谢组学的认识。

2.1 黑曲霉代谢组学研究

在黑曲霉FGSC A1279次级代谢调控研究试验中，通过对突变黑曲霉菌株进行代谢物的提取与检测。选取全局性调控因子lae A缺失及过量表达菌株为研究对象，以硅胶柱色谱、正反相薄层板、葡聚糖凝胶柱SephadexLH-20和液相等色谱方法对黑曲霉（A.niger）lae A过表达菌株的乙酸乙酯萃取物进行分离，从中分离得到4种化合物。采用核磁共振谱、红外光谱、质谱等谱学手段确定了羟基苯甲酸、3，4-二羟基苯甲酸以及邻苯二甲酸二异丁酯3种化合物的结构，除此之外还有一种化合物的结构待定。对所得到的化合物相关合成途径进行了初步分析，为进一步研究黑曲霉次级代谢基因簇的调控提供了基础数据。

此外基于13C代谢流和基因组规模代谢网络模型的黑曲霉产糖化酶代谢调控机理研究，采用同位素稀释法（IDMS）的代谢物组学和13C代谢流关联分析技术研究了黑曲霉高产菌A.niger DS 03043和模式菌A.niger CBS 513.88的代谢差异及调控机制。发现黑曲霉高产菌A.niger DS 03043有相对较高的生长速率，产酶速率和糖耗速率以及较低的草酸和柠檬酸分泌速率。原因在于与野生型模式菌A.niger CBS 513.88相比，高产菌中胞内代谢流分布出现调整即更多的碳源流向了PP途径而其三羧酸循环（TCA）途径通量相对较低，从而使得糖化酶的产量得到提高。这一研究结果表明，黑曲霉中能量和还原力代谢在细胞主要代谢途径通量分布调控中起着重要的作用。

在黑曲霉高产柠檬酸机制及代谢调控研究中，为进一步对黑曲霉产柠檬酸菌株进行遗传转化系统的建立，运用基因组学代谢组学相结合完成试验。在对胞外代谢产物进行定量分析时，采用HPLC技术检测胞外代谢产物。样品经13 000 r/min离心5 min收集上清液，并用孔径0.45 μm滤膜过滤，-20℃冻存。利用Amethyst C18-H色谱柱（Sepax technoligies，Inc.），以0.01%H3PO4为流动相，流速0.8 mL/min，温度30℃，利用紫外检测器在210 nm处进行检测。结果表明细胞内任一酶过量均会造成细胞的损伤使胞外代谢产物增加。

2.2 链霉菌代谢组学研究

相比于黑曲霉代谢组学研究，链霉菌的代谢组学研究正逐渐走向成熟。在对灰色链霉菌JSD-1发酵工艺及代谢产物研究中，运用GC/TOFMS（Leco Corp.,St.Joseph，MI）对处理后的样品进行测试，检测到JSD-1菌体生长代谢1 000多个分离峰，然后利用SIMCA软件进行PCA和OPLS分析。结果发现JSD-1生长代谢中转化氨基酸的能力最强，这些前体物质一部分通过转化成TCA循环的中间物质参与到菌体TCA循环中，一部分作为氮源直接被菌体吸收利用促进菌体的生长繁殖。

此外对于天蓝色链霉菌代谢物组测定方法优化及其代谢特征中提到，以天蓝色链霉菌为研究对象，对其代谢物组样品制备方法进行了系统优化，并利用GC-MS分析平台分析了该菌株的主要代谢特征。经检测结果比对发现糖酵解途径、磷酸戊糖途径（PPP）和三羧酸循环（TCA）在对数期有较高的代谢强度。在对链霉菌代谢组学研究的技术方法了解后，能够更有效地为黑曲霉代谢组学研究提供可靠的技术参考。

2.3 黑曲霉代谢组学研究技术进展

在Francisca Lameiras等人的研究下，开发一种恒化器，用于常规涡轮搅拌生物反应器中进行黑曲霉均匀稳态培养和丝状真菌的快速取样，并且进行冷甲醇淬灭结合冷过滤的系统研究，使这种方法运用于代谢组学研究中。采用恒化器培养的黑曲霉生长均匀且菌丝不会出现附着培养器壁生长的现象。运用这种快速采样装置和高效的冷甲醇淬灭方法，同时结合快速冷却过滤、快速采样、收集和洗涤菌丝体，从而实现精确的定量代谢组学研究。研究发现在-20℃下，40%甲醇水溶液混合物能实现最小的代谢物泄漏。总之，通过这项技术能为进一步研究代谢组学和代谢物运输研究作出贡献。

3 问题与展望

目前，代谢组学日益成为科研工作者关注的热点，国内外研究学者也逐渐对代谢组学的研究加以重视，然而代谢组学还面临着许多问题有待于解决。①缺乏建立标准的灭活和代谢物提取方法，以及对灭活过程中引起的胞内代谢物泄漏问题的评价与分析方法。②在代谢物的检测技术方面仍有缺陷，新的多维分离技术如二级气相色谱分析时间谱的检测范围更为广泛，但由于此方法检测过程中的费用昂贵没得到大规模的推广；气相质谱联用技术（GC-MS）使用时，需要对有较强挥发性的代谢产物进行衍生化预处理，此过程消耗的时间过长且容易引起样品发生一些化学变化。代谢产物分析平台的缺乏，由于代谢产物的理化性质复杂，对分析平台的要求十分严格，目前还没有一个很好的分析平台能够完成。③随着代谢组学的发展，对于代谢组学研究的数据库并没有得到很好的完善，包括代谢轮廓、代谢标志物等信息的缺乏。这些问题使得代谢组学的发展受到限制。同样对黑曲霉代谢组学的研究，仍处于发展阶段，在对黑曲霉复杂多样的代谢产物进行分离、分析检测方面仍存在技术缺陷，目前还没能找到更为理想的技术方法，并且代谢组学研究数据库有待于进一步完善。

随着科学技术的发展，相信代谢组学技术也将会逐渐得到完善，黑曲霉代谢组学研究也将取得巨大的进步。代谢组学未来将开发出更灵敏、更广谱、更通用的检测方法，对各谱峰所对应的化合物结构进行鉴定，进而有助于全面阐释细胞内部的工作机理；代谢组学与其他系统生物学组学技术紧密结合。基因与蛋白质的表达相联系，而代谢组学能够更好地反应细胞对营养和环境等外界因素的响应，通过与基因组学和蛋白质组学相结合进一步弄清楚生物机体的工作原理和相互之间的联系。此外将代谢组学的研究运用在黑曲霉这类真菌上，能够使复杂的代谢产物清晰的构建出其代谢网络图谱，并且能全面深入地揭示黑曲霉机体自身的调控能力，为今后黑曲霉的研究与利用提供更为可靠的数据。

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