艾塞那肽对高糖所致新生乳鼠心肌细胞钙信号紊乱的调控作用

陈泽龙，余怀新，陈淑娟，刘君英，刘文娟，邓建新，汪新宇，阎德文

(1深圳市第二人民医院，广东深圳518035；2深圳大学医学院)

艾塞那肽对高糖所致新生乳鼠心肌细胞钙信号紊乱的调控作用

陈泽龙1，余怀新1，陈淑娟1，刘君英1，刘文娟2，邓建新1，汪新宇1，阎德文1

(1深圳市第二人民医院，广东深圳518035；2深圳大学医学院)

目的 观察GLP-1类似物艾塞那肽(EX-4)对高糖所致新生乳鼠心肌细胞钙信号紊乱的调控作用，探讨GLP-1的心脏保护机制。方法 分离新生乳鼠心肌细胞，培养24 h后随机分为对照组、高糖组和高糖+EX-4组，分别加入25 mmol/L甘露醇、25 mmol/L葡萄糖、25 mmol/L葡萄糖+10 nmol/L EX-4，继续培养24 h。使用激光共聚焦显微技术检测各组心肌细胞自发钙火花发放频率、场刺激钙瞬变幅度、钙库容量；使用膜片钳技术记录L型钙通道电流。结果 对照组、高糖组、高糖+EX-4组的心肌细胞自发钙火花发放频率分别为(1.35±0.07)、(3.86±0.27)、(1.99±0.15)个/(μm·s)，场刺激钙瞬变幅度钙瞬变幅度分别为3.95±0.08、3.34±0.07、4.09±0.12，钙库容量分别为4.95±0.18、3.26±0.09、4.59±0.15，10 mV时的L型钙通道电流密度分别为-12.46±0.58、-11.28±0.55、-13.09±0.64,高糖组心肌细胞钙火花发放频率、钙瞬变幅度较对照组升高，钙库容量、电流密度较对照组降低(P<0.05或<0.01)，高糖+EX-4组钙火花发放频率、钙瞬变幅度较高糖组降低，钙库容量、电流密度较高糖组升高(P<0.05或<0.01)，与对照组比较无统计学意义。结论 EX-4能够增强心肌细胞L型钙通道电流，减少肌浆网钙漏流，从而有效纠正高糖所致心肌细胞钙调控紊乱，降低高糖所致心肌损伤。

艾塞那肽；心肌细胞；高血糖；钙火花；钙瞬变幅度；L型钙通道电流；激光共聚焦显微技术

糖尿病是心血管疾病的重要危险因子之一。高血糖作为一个独立的危险因子，可直接引起心肌损伤，且不依赖于血管疾病[1]。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由人胰高血糖素基因编码，并由肠道L细胞分泌的一种肽类激素。GLP-1具有促进葡萄糖诱导的胰岛素分泌、降低血糖水平、减轻体质量等作用，但其在生物体内的半衰期短。GLP-1类似物艾塞那肽(EX-4)具有与GLP-1相同的作用，而且作用时间更长，能够更好地控制血糖[2]。近年研究报道，EX-4具有心肌保护作用，但具体机制尚不完全清楚[3，4]。心肌细胞对钙离子具有调控作用，保持细胞内钙离子的动态平衡，从而维持细胞正常的舒缩功能。一旦钙离子的动态平衡被打乱，心脏功能甚至结构都可能发生异常。多种疾病模型可显著增加心肌细胞自发钙火花频率，降低肌浆网钙库容量水平，最终降低单细胞收缩期钙瞬变大小和收缩幅度，引起心脏功能障碍[5]。2014年12月～2015年12月，我们采用倒置共聚焦显微镜线扫描方式研究高糖对心肌细胞钙信号的影响，以及EX-4对高糖引起的钙信号紊乱的调控作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 SD新生大鼠，1～3日龄。EX-4注射液(美国Baxter Pharmaceutical Solutions LLC产品)；HEPES、蛋白酶XIV(美国Sigma公司)，Ⅱ型胶原酶(美国Worthington公司)，钙荧光指示剂Fluo-4 AM(美国Invitrogen公司)，其余为国产分析纯。LSM-780型倒置共聚焦显微镜(德国卡尔蔡司)，微量多管道给药系统(华中科大仪博生命科学仪器)，YC-2型电子刺激器(成都仪器厂)，EPC10膜片钳系统(德国HEKA公司)。

1.2 心肌细胞的分离与培养 采用胰蛋白酶消化的方法分离乳鼠心肌细胞。取乳鼠开胸，快速取出心脏，置于冰冷的PBS缓冲液中。取心尖部组织剪成1 mm3碎块，加入胰蛋白酶消化。弃上清，剩余组织块加入混合消化酶(0.08%胰蛋白酶和0.04%～0.06%Ⅱ型胶原酶等量混合)，37 ℃水浴消化，将各次消化制成的细胞悬液合并后，通过150目孔径的不锈钢网滤过。将细胞悬液接种于直径60 mm培养板中，采取差速法贴壁心肌细胞,37 ℃，5% CO2培养箱中孵育1 h，分离纯化心肌细胞。将纯化后的细胞按0.8×105～1.0×105/m2接种于直径35 mm培养皿中。

1.3 心肌细胞的分组与处理 将细胞随机分成对照组、高糖组、高糖+EX-4组，分别给予甘露醇25 mmol/L、25 mmol/L葡萄糖、10 nmol/L EX-4+25 mmol/L葡萄糖培养24 h。

1.4 心肌细胞自发钙火花发放频率检测 将培养后的心肌细胞与Fluo-4 AM室温避光共孵育10 min，洗去多余的荧光染料，置于倒置共聚焦显微镜系统的载物台上，台氏液灌流细胞。40倍镜下采用相同的放大倍数、线扫描方式进行采集图像信号，采样速率为3.84 ms/line，共采集1 000条线，激发光波长为488 nm，收集波长505 nm以上的发射光。以钙火花发放个数除以采样时间计算钙火花发放频率。

1.5 心肌细胞收缩期钙瞬变幅度检测 将加载好荧光染料的细胞置于Zeiss LSM-780倒置共聚焦显微镜系统的载物台上，台氏液灌流细胞。用线扫描方式采集图像数据，采样速率为3.84 ms/line。使用YC-2型电子刺激器给予细胞1 Hz、10 V的场刺激，细胞随刺激节律收缩，实时钙荧光强度随细胞节律性收缩而发生节律性变化，待钙荧光强度平稳变化后开始记录实时钙荧光变化。数据保存后再分析，本底荧光记为F0，荧光最大值记为F，钙瞬变幅度=(F-F0)/F0。

1.6 心肌细胞钙库容量检测 将加载好荧光染料的细胞置于共聚焦显微镜系统的载物台上，通过快速微量多管道给药系统在待测量的心肌细胞旁边给予20 mmol/L咖啡因连续刺激，清空肌浆网内钙库，直到记录完毕。采用线扫描方式采集图像数据，本底荧光记为F0，荧光最大值记为F，钙库容量=(F-F0)/F0。

1.7 心肌细胞L型钙通道电流检测 从培养箱取出细胞，用细胞外液洗3次去除培养基，换上细胞外液后把细胞置于倒置显微镜上，选取状态好的单细胞进行实验。记录L型钙通道电流的细胞外液为(mmol/L)：NaCl 137、KCl 5.4、NaH2PO41.2、MgCl21.2、葡萄糖10、HEPES 20、TTX、0.02，pH 7.4。电极内液(mmol/L)：CsOH 120、Aspartate 120、MgCl21、MgATP 4、HEPES 10、EGTA 5、TEA-Cl 20，CsOH调整pH至7.2，电极充以电极内液，入水后阻抗为2～5 MΩ。采用EPC-10放大器，以全细胞记录方式记录L型钙通道电流和细胞电容，电流大小(pA)和电容(pF)应用Clampfit10.0程序分析处理，以pA/pF计算电流密度。

2 结果

2.1 各组细胞自发钙火花发放频率比较 对照组、高糖组、高糖+EX-4组细胞自发钙火花发放频率分别为(1.35±0.07)、(3.86±0.27)、(1.99±0.15)个/(μm·s)。高糖组钙火花频率较对照组增加，高糖+EX-4组较高糖组降低，高于对照组(P<0.05或<0.01)。

2.2 各组细胞收缩期钙瞬变幅度比较 对照组、高糖组、高糖+EX-4组细胞收缩期钙瞬变幅度分别为3.95±0.08、3.34±0.07、4.09±0.12。高糖组钙瞬变幅度较对照组降低(P<0.05)，高糖+EX-4组较高糖组升高(P<0.05)，与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。

2.3 各组心肌细胞钙库容量比较 对照组、高糖组、高糖+EX-4组心肌细胞钙库容量分别为4.95±0.18、3.26±0.09、4.59±0.15。高糖组钙库容量较对照组降低,高糖+EX-4组较高糖组增加(P均<0.01)，高糖+EX-4组仍低于对照组(P<0.05)。

2.4 各组心肌细胞L型钙通道电流密度比较 电流-电压曲线显示，电流呈典型的倒钟型曲线，各组电流峰值在10 mV。对照组、高糖组、高糖+EX-4组在10 mV时的电流密度分别为-12.46±0.58、-11.28±0.55、-13.09±0.64。高糖组电流密度低于对照组，高糖组+EX-4组较高糖组升高(P<0.01)，与对照组相比无统计学差异。

3 讨论

糖尿病心肌病是造成糖尿病合并心血管疾病患者死亡的重要原因。高糖可致活性氧、活性氮等自由基升高，造成心肌细胞氧化应激损伤，从而引起糖尿病心肌病的发生。EX-4是以双激素缺陷为靶向的新型降糖药物。EX-4为肠促胰素类似物，其作为GLP-1受体激动剂，可与GLP-1受体结合，发挥类GLP-1的作用从而降低血糖。研究发现，EX-4具有心血管保护作用，能改善内皮细胞功能、促进钠排泄、改善缺血损伤的心肌，恢复心功能，减少心血管疾病的危险因素[6]。

在哺乳动物心肌细胞兴奋-收缩耦联过程中，细胞膜去极化激活电压依赖性钙通道引起细胞外钙离子内流，内流的钙离子通过钙-钙释放机制触发肌浆网大量释放钙离子，胞内钙离子浓度瞬间升高，引起细胞收缩[7]。随后，胞质钙离子通过肌浆网上的钙泵回收，少量通过钠-钙交换排出胞外，引起细胞舒张。因此，心肌细胞对钙离子复杂而又精细的调控，使得细胞内钙离子保持动态平衡，从而保证细胞正常的舒缩功能。一旦钙离子的动态平衡被打乱，心脏功能甚至结构都可能发生异常。研究表明，长期高糖血症导致心肌细胞能量代谢异常通路激活、氧化应激压力增加和线粒体功能异常，引起心肌细胞钙超载，即静息期胞质钙离子浓度升高，可能是导致心肌功能障碍的重要原因[8，9]。

心肌细胞收缩期的钙主要来自肌浆网钙库，而肌浆网钙主要经Ryanodine受体(RyR)通道释放到胞质。既往研究认为，收缩期RyR开放不足会造成肌浆网钙释放减少，心肌收缩力下降。而舒张期RyR活动对心脏功能的影响直到近年才逐渐被认识[10，11]。正常心肌细胞舒张期RyR通道主要处于关闭状态，自发性钙火花频率较低，有利于维持正常的肌浆网钙库容量。而糖尿病模型大鼠离体心肌细胞舒张期RyR活性增强、异常开放，自发钙火花发放频率显著增加，肌浆网钙漏流增加[12]。肌浆网钙漏流的一个直接后果是引起肌浆网钙库部分耗竭，收缩期细胞内钙释放不足，导致收缩期钙瞬变幅度降低，心肌收缩力降低。与此同时，肌浆网钙漏流引起的心肌细胞静息期胞质钙浓度升高(钙超载)，进一步损伤心肌细胞。我们的前期研究发现，高血糖及AGEs可以增加肌浆网RyR受体对钙离子的敏感性，心肌细胞舒张期自发钙火花发放频率显著升高，钙火花介导的肌浆网钙漏流增加，最终导致钙库容量水平下降，钙瞬变幅度下降；抑制晚期糖基化终产物受体能显著减少心肌细胞钙火花的频率，对心功能具有较好的保护作用[13]。在本研究中，高糖组的自发钙火花频率增加，导致肌浆网钙库容量水平部分耗竭，最终降低心肌细胞舒张期钙瞬变幅度。EX-4减少高糖引起的肌浆网钙漏流，恢复钙库容量，减弱高糖所致的细胞损伤，从而起到保护心功能的作用。这与体外培养的细胞系实验结果吻合，在体外培养的HL-1心肌细胞系中，GLP-1类似物利拉鲁肽可以明显改善正常培养HL-1细胞的钙瞬变幅度，改善肌浆网钙库容量[14]。这些研究结果提示，钙火花介导的肌浆网钙漏流可能是糖尿病心肌病发生的重要机制。

在心肌细胞中，舒张期钙瞬变幅度不仅与钙释放单元有关，还与触发信号——L型钙通道电流有密切的联系，L型钙通道电流约占钙释放的10%。研究显示，在大动物如犬的心室肌细胞中，GLP-1通过激活依赖性蛋白激酶A通路显著增加增强心脏L型钙电流，延长动作电位时程，从而起到正性心肌的作用[15，16]。本研究发现，EX-4治疗后可以增加乳鼠心肌细胞L型钙通道电流密度，使兴奋-收缩耦联过程中的触发信号增强，增加钙瞬变幅度；表明EX-4在减少钙漏流的同时增强触发信号，从而发挥心肌组织的保护作用。

综上所述，GLP-1类似物EX-4能够通过增强心肌细胞钙电流，减少肌浆网钙漏流，稳定心肌局部钙信号，起到良好的心肌保护作用，对延缓糖尿病心肌病的发展具有重要意义，为糖尿病心肌病的防治提供了新的思路。

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Regulating effect of exenatide on disorder of calcium signal in neonatal rat cardiomyocytes induced by high glucose

CHENZelong1,YUHuaixin,CHENShujuan,LIUJunying,LIUWenjuan,DENGJianxin,WANGXinyu,YANDewen

(1SecondPeople'sHospitalofShenzhen,Shenzhen518035,China)

Objective To investigate the regulating effect of GLP-1 analogue exenatide (exenatide-4, EX-4) on the disorder of calcium signal in neonatal rat cardiomyocytes induced by high glucose and the cardioprotective mechanism.Methods The neonatal rat cardiomyocytes were isolated and cultured for 24 h, and then were randomly divided into 3 groups: the control group, high glucose group and high glucose +EX-4 group which were separately treated with 25 mmol/L mannitol, 25 mmol/L high glucose and 25 mmol/L high glucose+10 mmol/L EX-4. The frequency of spontaneous Ca2+spark in cadiomyocyte, field-stimulated calcium transient amplitude and calcium storage capacity were detected by laser scanning confocal microscopy. L-type calcium channel current was recorded by using patch-clamp technique.Results The frequencies of spontaneous Ca2+spark in cadiomyocytes of the control group, high glucose group and high glucose+EX-4 group were (1.35±0.07), (3.86±0.27) and (1.99±0.15)/(μm·s), respectively. Field-stimulated calcium transient amplitude was 3.95±0.08, 3.34±0.07 and 4.09±0.12. The calcium storage capacities were 4.95±0.18, 3.26±0.09 and 4.59±0.15, respectively. L-type calcium channel current density at 10 mV were -12.46±0.58, -11.28±0.55, and -13.09±0.64. In the high glucose group, the frequency of Ca2+spark and the Ca2+transient amplitude were higher than those of the control group (P<0.05 orP<0.01), and calcium storage capacity and L type calcium current density were lower than those in the control group (P<0.05 orP<0.01). In the high glucose+EX-4 group, the frequency of Ca2+spark and the amplitude of Ca2+transient were higher than those of the high glucose group (P<0.05 orP<0.01), and calcium storage capacity and L type calcium current density were higher than those of the high glucose group (P<0.05 orP<0.01), while there was no statistically significant difference as compared with those of the control group. Conclusions EX-4 can increase L-type Ca2+current in cardiomyocytes, and reduce the Ca2+leakage current in the plasma, thus effectively correcting the disorder of Ca2+regulation in cardiomyocytes induced by high glucose. Therefore, EX-4 has good myocardial protective effect on patients with diabetes mellitus.

exenatide; cardiomyocytes; hyperglycemia; calcium sparks; calcium transient amplitude; L type calcium channel current; laser scanning confocal microscopy

国家自然科学基金资助项目(31400982)；深圳市科技计划项目(JCYJ20140416180300394,JCYJ20150330102720148,JCYJ20140418182819136)。

陈泽龙(1975-)，男，副主任医师，主要研究方向为糖尿病心脏病的临床治疗。E-mail: czlsz@139.com

阎德文(1964-)，男，博士，教授，主要研究方向为糖尿病心肌病的发病机制。E-mail: yandw963@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.06.006

R542.2

A

1002-266X(2017)06-0020-04

2016-11-07)