浅谈微生物发酵中试的影响因素

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(杭州中美华东制药有限公司 微生物技术平台，浙江 杭州 310011)

浅谈微生物发酵中试的影响因素

平丽英，陈琳，方丽纳，匡春兰，傅立峰

(杭州中美华东制药有限公司 微生物技术平台，浙江 杭州 310011)

微生物发酵中试是实验室小规模生产工艺路线打通后，在模拟工业化生产条件下所进行的工艺研究，以验证放大生产后原工艺的可行性，尽可能保证研发和生产时工艺的一致性.发酵中试放大的目的是验证、复审和完善实验室工艺所确定的反应条件，为正式生产提供数据.微生物发酵中试是产品研发到生产的必经之路，是连接研发和生产的纽带，不仅为产业化生产积累必要的经验及提供数据支持，同时也是降低产业化实施风险的有效措施.微生物发酵中试有诸多影响因素，因此研究并合理利用其影响因素具有重要意义.

微生物发酵；发酵中试放大；影响因素

微生物发酵具有生产工艺相对简单、生产成本低、产量高且可工业化生产等优势.微生物工业发酵过程不同于一般化工生产，是借助于微生物个体在一定培养条件、培养设备下参与的生化反应过程，因此具有其特殊性.微生物发酵中试是在小试的基础上进一步研究各工艺参数的变化规律，以解决实验室规模中不能解决或尚未发现的问题，是降低产业化实施风险的有效措施.微生物菌种、培养基、灭菌方式和培养条件(温度、pH、溶氧、搅拌形式及速度和黏度)等是影响微生物发酵中试的重要因素，研究并合理利用这些因素可以更好地为产业化服务，具有重要意义.

1 菌种及培养基

1.1 菌 种

菌种在微生物发酵过程中起着重要作用，是发酵工业的基础和关键.发酵期间，菌种的生长速度和产物合成的能力很大程度上取决于菌种的发酵能力及稳定性.为改善菌种的特性，提高发酵水平，满足产业化生产的需求，必须进行菌种选育工作，菌种选育在提高产品质量和产量、改善工艺条件等方面发挥着重要作用[1].例如，Conte等采用紫外诱变方法，获得黑曲霉突变株FR13，柠檬酸产率较出发菌株提高了近一倍[2].上海师范大学杨正行采用自然筛选及紫外诱变等方法，获得了莫匹罗星高产突变株，其发酵产莫匹罗星水平较出发菌株提高了2.4倍[3].另外，Desai等通过紫外诱变及发酵培养基组分优化，使木聚糖酶产量提高了37%[4].

1.2 培养基

培养基不仅为微生物提供必需的营养物质，也为微生物生长创造必要的生长环境.生产中培养基的组成及配比是否合适，对微生物生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品的质量产量都有重要影响.工业生产中要根据菌种特性、微生物生长发酵阶段和发酵产物特点等因素合理配制使用不同成分及配比的培养基，为微生物提供适宜的营养物质，以满足菌体生长及合成产物的需求.

培养基配方优化能有效提高发酵代谢水平，在胞外多糖发酵过程中，通过培养基配方优化，5～30 kD的胞外多糖达到48.57 g/L[5].培养基中的某些金属离子对发酵代谢及产物活性有显著影响，例如，为了提高BacillussubtilisBS501a发酵产物的抗真菌活性，通过正交实验对培养基配方进行了优化，优化后其抑菌活性提高了2.4倍，同时，在优化过程中发现Mg2+对抑菌活性有显著影响[6].

2 灭 菌

绝大多数的工业发酵是需氧的纯种发酵.在发酵过程中，除生产菌外，不允许其他杂菌的生长，这就要求对使用的培养基、仪器设备等进行彻底的除菌处理.因此，灭菌和无菌操作是工业发酵的重要环节.培养基的灭菌情况对不同发酵产品的影响也不尽相同.一般而言随灭菌温度的升高、时间的延长对营养成分的破坏作用越严重，进而影响微生物的生长代谢及产物合成.葡萄糖是微生物培养过程中常用的有效碳源，但在高温灭菌时，葡萄糖与氨类物质会发生美拉德反应，使培养基产生有害色素，不利于微生物的生长，因此，一般应对培养基中的葡萄糖单独灭菌，并将温度控制在115 ℃，灭菌时间控制在20 min以内[7].

3 培养条件

3.1 温 度

温度主要通过影响微生物细胞内生物大分子的活性来影响微生物的代谢活动.同时，温度的变化也会引起其他环境因素的变化，进而影响微生物的生命活动.微生物生长和产物合成需要在其适宜的温度下进行，在发酵过程中不同的发酵阶段其最适温度往往不同.例如，乳酸链球菌在34 ℃时繁殖速度最快，在25～30 ℃时细胞产量最高，在40 ℃时发酵速度最快，在30 ℃时乳酸产量最高[8].

温度影响产物合成的同时还会影响其代谢的方向.金色链霉菌发酵生产四环素的同时也会生产金霉素，当温度低于30 ℃时以合成金霉素为主，随着温度的升高合成四环素的比例增加，当温度达到35 ℃时只生产四环素[9-10].温度对大肠杆菌等工程菌发酵的影响更加显著，一般在发酵初期，采用37 ℃培养，以利于大肠杆菌的生长，在对数生长期的中后期，加入诱导剂，同时降温培养，以利于目标蛋白的诱导表达.Studie在高密度发酵蛋白表达的研究中，大肠杆菌在生长阶段采用37 ℃培养，而蛋白表达阶段采用18 ℃低温诱导表达[11].

3.2 pH

发酵pH对微生物生长和产物的合成有较大影响.pH主要通过引起细胞膜电荷变化，改变细胞膜的通透性来影响营养物质的吸收和代谢产物的排泄，最终影响微生物的生长和产物的合成.不同微生物的最适pH有所不同，一般情况下细菌和放线菌适于中性偏碱性环境，而霉菌和酵母菌适于偏酸性环境.

同一微生物在不同的环境pH条件下会表现出不同的生长状态及发酵水平.例如，耐酸真菌PenicilliumpurpurogenumJS03-21在pH 2的培养基中生长良好，且发酵水平可达到最大值，随着pH的上升，发酵产量逐渐下降，当pH为碱性时，菌株虽能生长，但却不产生发酵产物[12].同一微生物在不同pH条件下也会产生不同的代谢产物.例如，黑曲霉在pH 2～3的培养环境下，产物以柠檬酸为主，当pH接近中性时，则大量产生草酸[13-15].谷氨酸生产菌在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下产生谷氨酰胺[12].因此，在发酵过程中，可根据不同的目的，采用pH调控以控制产物的合成.

微生物在不同的生长代谢阶段对pH的要求也不同.例如，谷氨酸发酵的前期需控制pH 7.5左右，发酵后期pH 7.0左右，在接近放罐时，为了后续的提取工作，pH以6.5～6.8为最佳[16].在ε-赖氨酸的发酵过程中，pH对菌体生长和产物合成有显著影响，在发酵初期pH维持5以上，有利于菌体生长，在发酵中后期pH维持在4左右以促进产物合成[17-18].因此，在发酵过程的不同阶段可分别控制不同的pH范围，以提高发酵产量及产品质量.

3.3 溶 氧

溶氧是需氧发酵控制最为关键的参数之一.氧在水中的溶解度很小，在发酵液中的溶解度亦是如此.在工业发酵过程中，可以通过控制通气量、罐体压力、选择合适的搅拌形式及速度等来满足微生物发酵对氧的需求.

在微生物发酵过程中，不同的发酵阶段，因微生物自身生长及代谢水平的变化，对溶氧的需求也会发生相应的变化.在发酵前期，菌体大量繁殖，溶氧逐渐降低，当降到一定量时，需要增加通气量和搅拌转速来维持溶氧水平；在产物合成期，菌体进入稳定期，对溶氧的需求也相对稳定；发酵后期，由于菌体衰老，溶氧开始回升，一旦菌体自溶，溶氧将明显上升.

溶氧对微生物生长、产物合成及产量都会产生不同程度的影响，因此，通过调控溶氧可有效促进微生物生长及提高其生产水平.例如，在PhotorhabdustemperataK122分批发酵生产生物杀虫剂的过程中，采用控制溶氧的发酵调控策略，当溶氧控制在50%时，生物量提高了41.1%，同时杀虫剂活性提高了32.1%[19].在谷氨酸发酵过程中，供氧不足时，会产生大量乳酸和琥珀酸，而谷氨酸产量则会明显降低[20].

3.4 搅拌形式及速度

搅拌能使发酵液充分混匀，使发酵液中的固形物保持悬浮状态，以利于营养物质的吸收及代谢产物的分散.此外，搅拌最主要的作用是打碎气泡，提高气-液接触面积，以提高气-液间的传质速率.不同的搅拌形式打碎气泡的能力及流体混合的效果也有所不同.在小试时由于物料体积小，搅拌效果好，传质、传热问题不明显，但在中试放大时必须根据物料性质和反应特点，注意搅拌形式和搅拌速度对发酵的影响规律，以便选择符合要求的搅拌器及确定合适的搅拌速度.目前，传统发酵罐普遍采用径向流动方式的圆盘涡轮桨，其主要缺点是混合性能差，且能耗较大.针对这一问题，王展等采用新型轴流式搅拌桨——英力桨，改进传统设计，同时结合凹面叶涡轮桨的组合应用获得了较好的气液分散和整体混合效果[21].

提高搅拌速度有利于发酵体系的传质，提高溶氧水平，但随着搅拌速度的逐渐增大，其对微生物的剪切力也逐渐增强.不适的剪切力不仅影响菌体的生长形态和生长速度，还会直接影响产物的合成.例如在ε-赖氨酸发酵过程中，当搅拌速度在400 r/min情况下，菌丝球呈不规则形状，影响细胞代谢及产量[17].

3.5 发酵液黏度

黏度是发酵液的一个重要物理参数.发酵液黏度测量方法简便、快捷且准确性高，可作为发酵调控的依据[22].常规发酵过程中，发酵液黏度与菌丝浓度呈正相关关系，发酵液黏度较小，菌量较低直接影响发酵产量；而发酵液黏度过大不仅影响物料和氧的传质，还会使菌体生长代谢异常，进而影响发酵水平及后续的分离纯化工作.在头孢菌素C的生产中，发酵液的黏度对发酵效价影响显著，发酵液后期表观黏度高于120 Pa·s或低于80 Pa·s的罐批比发酵液后期表观黏度在90～110 Pa·s的罐批效价低10%～15%[23].

适当的发酵液黏度是保证发酵水平的基础，但在中试放大过程中，常出现发酵液黏度异常的情况，因此控制发酵液黏度是发酵中试的重要研究内容.发酵液黏度过低，可通过增加接种量、升温培养、降低通气量及搅拌速度来调节.发酵液黏度过高，可采用定期消泡、低糖控制及补料来调控[22].例如，袁建栋等在纽莫康定Bo的发酵过程中，通过流补乳糖和氨水，在提高发酵水平的同时，能有效降低发酵液的黏度，进而提高后期分离纯化效率，降低生产成本[24].

4 结 论

发酵过程中各反应的本质不会因实验与生产的不同而改变，但最佳工艺条件可能随实验规模和设备等外部条件的不同而改变，这就是微生物发酵中试的意义所在.微生物发酵受菌种、培养基、灭菌方式和培养条件等因素影响，研究并合理利用这些因素，可以更好地为发酵工业生产服务.在具体生产实践中，应根据产品特性，综合考虑影响发酵过程的因素，以确定最佳工艺参数，为发酵产业化生产积累必要的经验及提供数据支持，从而降低产业化实施风险.

[1] MARZANO M, GALLO A, ALTOMARE C. Improvement of biocontrol efficacy ofTrichodermaharzianumvs.Fusariumoxysporumf. sp.lycopersicithrough UV-induced tolerance to fusaric acid[J]. Biological control, 2013,67(3):397-408.

[2] CONTE A P D, MARIN J M. Selection of 5-fluorocytosine-resistant mutants from anAspergillusnigercitric acid-producing strain[J]. Brailian journal of microbiology, 2003,34(1):1-4.

[3] 杨正行.莫匹罗星的菌种选育与发酵工艺的研究[D].上海:上海师范大学,2012.

[4] DESAI D I, IYER B D. Utilization of corn cob waste for cellulase-free xylanase production byAspergillusnigerDX-23: medium optimization and strain improvement[J]. Waste biomass valor, 2017,8(1):103-113.

[5] MALICK A, KHODAEI N, BENKERROUM N, et al. Production of exopolysaccharides by selectedBacillusstrains: optimization of media composition to maximize the yield and structural characterization[J]. International journal of biological macromolecules, 2017,102:539-549.

[6] LI R F, XU Y. Fermentation optimization to improve production of antagonistic metabolites byBacillussubtilisstrain BS501a[J]. Journal of central south university of technology, 2011,18(4):1047-1053.

[7] 秦晴.含葡萄糖培养基高温灭菌后糖组分的变化及对丙氨酸发酵的影响[J].甘肃农业科技,2017(6):13-15.

[8] 李滔.乳酸链球菌素发酵工艺研究[D].武汉:华中农业大学,2007.

[9] 繆克排.金色链霉菌发酵条件优化及高产菌株选育的新方法[D].杭州:浙江大学,2005.

[10] BANSAL O P. A laboratory study on degradation studies of tetracycline and chlortetracycline in soils of aligarh district as influencedby temperature, water content, concentration of farm yield manure[J]. Nitrogen and tetracyclines, 2012,82(4):503-509.

[11] STUDIER F W Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures[J]. Protein expression & purification, 2005,41(1):207-234.

[12] 刘强,王立平,王聪,等.Purpurquinone A的发酵条件优化[J].中国抗生素杂志,2016,41(4):247-254.

[13] 代真真.黑曲霉柠檬酸发酵过程研究及其优化[D].上海:华东理工大学,2011.

[14] KOSEGARTEN C E, RAMIREZ-CORONA N, MANI-LOPEZ E, et al. Description ofAspergillusflavusgrowth under the influence of different factors (water activity, incubation temperature, protein and fatconcentration, pH, and cinnamon essential oil concentration) by kinetic, probability of growth, and time-to-detection models[J]. International journal of food microbiology, 2017,240:115-123.

[15] CHIROVA T K, KUMAR A, PANWAR A. Citric acid production byAspergillusnigerusing different substrates[J]. Malaysian journal of microbiology, 2016,12(3):199-204.

[16] 邢宇,张丽叶,丛威,等.基于pH的反馈补料方法在谷氨酸发酵中的应用[J].生物工程学报,2011,27(10):1457-1463.

[17] 姜俊云,贾士儒,董惠钧,等.搅拌转速和pH对ε-赖氨酸发酵的影响[J].生物加工过程,2004,2(2):60-63.

[18] KITO M, TAKIMOTO R, YOSHIDA T, et al. Purification and characterization of an ε-poly-L-lysine-degrading enzyme from an ε-poly-L-lysine-producing strain ofStreptomycesalbulus[J]. Archives of microbiology, 2002,178(5):325-330.

[20] 刘剑,赵策,储炬,等.溶氧对谷氨酸棒杆菌发酵产谷氨酸代谢的影响[J].华东理工大学学报,2012,38(4):459-464.

[21] 王展,尹应武.新型搅拌桨在大型发酵罐中的应用[J].食品与发酵工业,2004,30(2):100-102.

[22] 王春魁.浅谈发酵液粘度在抗生素发酵生产中的探索和应用[J].科技风,2010(15):258,271.

[23] 鲍红霞,王孟强,任璐,等.头孢菌素C发酵液表观粘度及其对发酵的影响[J].天津科技大学学报,2006,21(4):55-58.

[24] 袁建栋,王其龙,别一.一种纽莫康定Bo的发酵方法:CN106755223A[P].2017-05-31.

Discussionsontheinfluencingfactorsofpilot-scalemicrobialfermentation

PING Liying, CHEN Lin, FANG Lina, KUANG Chunlan, FU Lifeng

(Microbial Technology Platform, Hangzhou Zhongmei Huadong Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou 310011, China)

Pilot-scale microbial fermentation is based on the small scale experiment in the lab, which is carried out under simulated industrial production conditions. To ensure the possibility for the future manufacture process, the research and the manufacture process should maintain consistency. The aim of the pilot of microbial fermentation is to verify and recheck the reaction conditions of the process obtained from small scale, providing the guidance for the industrial production. As the link between fundamental research and industrial production, pilot of microbial fermentation is not only necessary to the product development but also provides meaningful experiences and data support for industrial production. Moreover, it is an effective way to reduce the risk in realizing industrialization. Pilot of microbial fermentation is influenced by many factors. Thus, it is of great significance to study and utilize these factors.

microbial fermentation; pilot of microbial fermentation; infect factors

2017-09-18

平丽英(1984—)，女，吉林榆树人，工程师，硕士，研究方向为微生物发酵工程及代谢调控，E-mail：pingly@eastchinapharm.com.通信作者：傅立峰工程师，E-mail：fulifeng@eastchinapharm.com.

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1674-2214(2017)04-0212-04

朱小惠)