探究生物种间关系的实验活动

赵冉冉（上海海事大学附属北蔡高级中学上海 201204）

探究生物种间关系的实验活动

赵冉冉（上海海事大学附属北蔡高级中学上海 201204）

利用酿酒酵母与灰霉菌竞争营养物质的机理来防治红辣椒灰霉病，从而探讨三种生物的种间关系，以加深学生对生物种间关系的理解，丰富实验课的教学。

种间关系 灰霉菌 酿酒酵母 植物真菌病害 生物防治

文件编号：1003－7586（2017）01－0056－02

生物的种间关系是一个非常有趣的知识点，学生大都有一定的感性认识。人教版高中生物《必修3：稳态与环境》教科书中，给出了生物种间关系的一些基本概念，并列举了对应的例子，但例子比较简单，不利于学生积极性的调动以及手脑结合的运用。为了加深学生对该知识点的理解，增强动手能力，下面以实验“酿酒酵母对红辣椒灰霉病的生物防治作用”为例，探讨三种生物（红辣椒、灰霉菌和酿酒酵母）的种间关系。本探究实验不仅可以弥补该知识点缺乏相关配套实验的不足，同时还可以作为学生进行探究性学习的一个载体。

1 实验原理

灰霉菌是一种广寄主性的、能够引起多种蔬菜和水果灰霉病的坏死营养型病原真菌。在日常生活中遇到的果蔬长毛，多数是受到了灰霉菌的侵染。研究表明，灰霉菌分生孢子萌发需要适当的营养条件，植物表面水分中的营养物质可以被灰霉菌和拮抗菌所共用，从而使灰霉菌所能利用的营养物质浓度降低，使其芽管生长速度减慢。酵母菌是灰霉菌的主要拮抗菌，如酿酒酵母菌对灰霉菌就有很好的拮抗作用，可用于灰霉病的生物防治。

2 材料用具

灰霉菌、酿酒酵母：实验前均于4℃下保存于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上。

红辣椒：选用外观整齐、大小一致、无病虫害、无机械损伤，未用化学或生物药剂处理过的果实为实验材料，实验前用无菌水洗净备用。

葡萄糖溶液、质量分数为0.5%的NaCl溶液、体积分数为70%的乙醇溶液、无菌水、PDA培养基、培养皿、试管、无菌打孔器、接种环、移液枪、量筒、光学显微镜、恒温培养箱、塑料袋、直尺。

3 方法步骤

3.1 酿酒酵母对灰霉菌拮抗作用的体外生物防治实验

3.1.1 制备PDA有孔培养基

将红辣椒汁加入融化状态的PDA培养基中（每毫升培养基含0.15 g红辣椒汁），混匀后倒入无菌培养皿中，冷却至凝固；然后用无菌打孔器在凝固的平板中央打一个直径4 mm的孔。

3.1.2 配制菌悬液

将酿酒酵母和灰霉菌于28℃下分别培养于PDA斜面上48 h和72 h。用接种环挑取酿酒酵母菌种，以无菌水稀释，分别制成浓度为5×106、5×107、5×108、5× 109细胞/mL的酿酒酵母悬浮液；同样方法配制灰霉菌孢子悬浮液，浓度为5×104孢子/mL。

3.1.3 接种观察

将20 μL浓度分别为5×106、5×107、5×108、5×109细胞/mL的酿酒酵母悬浮液依次注入到4个PDA平板的孔中，保持1～2 h，使其充分渗入，之后同样位置注入20mL浓度为5×104作孢子/mL的灰霉菌悬液为实验组(b～e)；在另一个平板的孔中只注入20 μL浓度为5×104孢子/mL的灰霉菌孢子悬浮液，并充分渗入，作为对照组(a)。28℃下培养5 d，观察酿酒酵母和灰霉菌的生长情况，记录灰霉菌菌落直径。

3.2 酿酒酵母对灰霉菌拮抗作用的体内生物防治实验

3.2.1 果实处理

将红辣椒果实于质量分数为0.5%的NaCl溶液中浸泡5 min，以除去表皮污物；然后用无菌水洗净，空气干燥后，用体积分数为70%的乙醇溶液处理；最后用无菌打孔器将果实表皮打上伤口（伤口直径4 mm，深度1 mm），一个果实一个伤口。

3.2.2 接种观察

将20 μL浓度分别为5×106、5×107、5×108、5×109细胞/mL的酿酒酵母悬浮液依次注入到果实伤口处，1～2 h之后，同样位置注入20 μL浓度为5×104孢子/mL的灰霉菌悬浮液，作为实验组(c～f)。对照组a只注入20 μL浓度为5×109细胞/mL的酿酒酵母悬浮液，对照组b只注入20 μL浓度为5×104孢子/mL的灰霉菌孢子悬浮液。将处理后的果实装入塑料袋，28℃下密封避光保存，5 d后记录果实表面病灶直径（病灶直径用以衡量红辣椒果实灰霉病的严重程度）。

3.3 营养竞争实验

取5支试管，各加入2 mL 0.15 g/mL的红辣椒汁；在其中3支试管中依次加入2mL 0.1、0.5、1.0g/mL的葡萄糖溶液，再将50 μL浓度为5×109细胞/mL的酿酒酵母悬浮液和50 μL浓度为5×104孢子/mL的灰霉菌孢子悬浮液共同接种于以上试管中，记为实验组（c～e）；余下2支试管，其中1支加入50 μL浓度为5×109细胞/mL的酿酒酵母悬浮液和50 μL浓度为5× 104孢子/mL的灰霉菌孢子悬浮液，记为对照组b；另1支只加入50 μL浓度为5×104孢子/mL的灰霉菌孢子悬浮液，记为对照组a。所有试管均于28℃下培养16 h。显微观察，计算孢子萌发率（灰霉菌每复制1次至少有50个孢子）。

4 实验结果

4.1 体外实验中不同浓度酿酒酵母悬浮液对灰霉菌生长的抑制作用

用体外平板实验来确定酿酒酵母抑制作用的最适浓度。对照组平板（a）上灰霉菌菌落的直径为4.6 cm；实验组平板（b～e）上灰霉菌菌落的直径随酿酒酵母悬浮液浓度的升高(5×106、5×107、5×108、5×109细胞/mL)而逐渐减小，从3.7 cm降至2.2 cm。

4.2 体内实验中不同浓度酿酒酵母悬浮液对灰霉菌生长的抑制作用

体内实验的结果显示出类似的酵母悬浮液浓度对灰霉菌生长的抑制作用。对照组（b）辣椒果实的病灶直径为1.3 cm；实验组（c-f）果实病灶直径随酿酒酵母悬浮液浓度的升高(5×106、5×107、5×108、5×109细胞/mL)而逐渐减小，从1.1 cm降到0.6 cm。

图1所示病变区域一开始有水样点，然后水样点逐渐扩散成灰棕色、质地如海绵的区域，表面覆有灰霉菌菌丝和孢子。酿酒酵母生长速度越快，就越干扰灰霉菌的生长，并竞争营养物质。然而，只接种酿酒酵母的红辣椒果实没有出现病变（图1a），这就表明，酿酒酵母不影响红辣椒活细胞的生长，但是它会在植物受伤部位生长。

4.3 灰霉菌和酿酒酵母之间的营养竞争

图1 不同浓度酿酒酵母悬浮液对红辣椒果实病灶直径的影响

28 ℃条件下，显微观察到对照组a灰霉菌分生孢子萌发率为91.2%，对照组b的萌发率为24.6%。结果表明，酵母菌干扰灰霉菌孢子萌发的过程。然而，孢子萌发率在葡萄糖质量浓度为0.1 g/mL时为35.7%，当浓度上升到0.5 g/mL时，萌发率为56.2%，上升到1.0 g/mL时，萌发率为70.5%。这表明，酿酒酵母抑制灰霉菌生长的能力随葡萄糖浓度升高而降低。

5 结论与建议

灰霉菌引起红辣椒果实病变，表明了两者的寄生关系。酿酒酵母利用红辣椒果实的营养物质，保护其细胞免受病原菌感染，说明了两者的互利共生关系。酿酒酵母通过争夺养分而抑制灰霉菌孢子萌发，可解释两者的竞争关系，但二者对养分的争夺并不是唯一的机制，酿酒酵母也可产生酒精和毒素杀死灰霉菌，灰霉菌也能产生抗真菌剂杀死酿酒酵母。

笔者建议学生在学校实验室中进行该实验，实验过程中所使用到的灰霉菌和酿酒酵母对学生没有危害。在实验材料的选取上，学生可以尝试使用番石榴、番茄或苹果进行实验，将会得到和用红辣椒做实验相同的结果。该实验的进行不仅可以使学生了解到生物的3个主要种间关系（寄生、竞争、互利共生），并且还可以给学生一个批判性思考低等生物（微生物）和高等生物（植物）之间关系的机会。

［1］孟祥东,傅俊范,严雪瑞等.灰霉病菌（Botrytis cinerea）生物防治研究进展[J].沈阳农业大学学报,2003,34(6):472-475.

［2］Arun Chanchaichaovivat a,Bhinyo Panijpan a&Pintip Ruenwongsa a.Yeast biocontrol of a fungal plant disease:a model for studying organism interrelationships[J].The Journal of Biological Education.2008,43(1):36-40.

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