MicroRNA-203抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移的机制研究

郭清皓，蔡钧，杨世疆，蒋林涛

（华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院 急诊创伤外科，湖北 武汉 430014）

MicroRNA-203抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移的机制研究

郭清皓，蔡钧，杨世疆，蒋林涛

（华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院 急诊创伤外科，湖北 武汉 430014）

目的探讨microRNA-203（miR-203）对骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响及机制。方法 通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定miR-203在正常成骨细胞hFOB及骨肉瘤细胞系中的表达，将MG-63细胞系分成miR-203组、Scramble组、RAB22A组、NC组，Lipofectamine 2000分别转染miR-203 mimics、Scrambles、pcDNA3.1-RAB22A、空白对照质粒；通过噻唑蓝（MTT）实验测定增殖能力，细胞划痕实验测定迁移能力；通过Target Scan和双荧光素酶实验预测及验证miR-203与RAB22A基因的靶向调节关系；RT-PCR测定RAB22A mRNA表达水平；Western blot测定E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平。结果 miR-203在骨肉瘤细胞系SAOS-2、SOSP-9607、U2OS及MG-63中较hFOB细胞系表达降低。MTT显示，在培养48和72 h后，miR-203组相对细胞数少于Scramble组（P＜0.05）；培养24 h后，Scramble组细胞相对划痕面积小于miR-203组（P＜0.05）；双荧光素酶实验示，miR-203与RAB22A基因存在靶向调节关系。RAB22A组相对划痕面积小于NC组（P＜0.05）；MTT显示，在培养24、48和72h后，RAB22A组相对细胞数多于NC组（P＜0.05）；RAB22A组与NC组比较，E-cadherin下调表达，N-cadherin上调表达，Vimentin上调表达。结论 miR-203通过下调RAB22A基因表达，抑制上皮间质转化，进而抑制骨肉瘤细胞增殖与迁移。

miR-203；RAB22A；骨肉瘤；增殖；迁移

骨肉瘤多发于儿童或青少年，其常转移部位是肺、胸膜[1-2]。进一步明确骨肉瘤的发病机制对提高诊疗水平具有重要意义。MicroRNA（miRNAs）是一类内源性的非编码RNAs，其通过mRNA的3’非编码区结合而靶向下调基因表达[3-4]。miRNAs调控着细胞周期、增值、凋亡等过程[5]。研究报道，miR-203参与乳腺癌、前列腺癌、食道鳞癌等多种肿瘤的增殖、迁移及侵袭过程[6-8]。然而，目前尚无miR-203对骨肉瘤增殖迁移影响的报道，本文研究microRNA-203 （miR-203）对骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

人成骨细胞系 hFOB、SAOS-2、SOSP-9607、U2OS及MG-63骨肉瘤细胞系购自武汉大学医学院实验中心，无血清细胞冻存培养基（roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）、胎牛血清及胰蛋白酶购自美国Hyclone公司，Trizol购自美国Invitrogen公司，实验所需的一抗购自美国Santa Cruz公司，二抗购自武汉博士德生物科技有限公司，miR-203 mimics和Scrambles由上海吉玛基因化学技术有限公司定制合成，pcDNA3.1-RAB22A由美国Genscript公司定制，Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2 细胞培养、转染及分组

所有细胞系采用RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清和抗生素）培养于37℃、5%二氧化碳CO2、饱和湿度的恒温细胞培养箱中。为探讨miR-203过表达对MG-63细胞系增殖和迁移的影响。将对数生长期的MG-63细胞系分成两组，分别为miR-203组和Scramble组，按Lipofectamine 2000说明书分别转染miR-203 mimics和Scrambles，终转染浓度为20nmol。培养24h后行噻唑蓝[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]和细胞划痕实验。为探讨RAB22A过表达对MG-63细胞系增殖和迁移的影响及其机制，将MG-63细胞系分成两组，即RAB22A组和NC组。采用Lipofectamine 2000分别转染 pcDNA3.1-RAB22A和空白对照质粒，培养24 h后行MTT及细胞划痕实验。

1.3 RNA提取和实时荧光定量聚合酶链反应

按Trizol reagent说明书，从培养细胞中提取总RNA，然后按照TaqMan RNA reverse transcription kit（美国ABI公司）说明书，5 ng总RNA逆转录合成cDNA。在ABI 7500实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪中，以β-actin作为内参，量化miR-203的表达水平。使用SYBR Green PCR master mix试剂（美国Roche公司）在ABI 7500 qRT-PCR仪中进行qRT-PCR。miR-203正向引物：5'-GCTTTTGAGA ACGTGGATGAG-3'；反向引物：5'-CGAAGATGGTGG CATAGAGAA-3'；使用2-ΔΔCt方法定量，以U6小核RNA作为内参，计算miR-203的相对表达量。

1.4 生物信息学分析及预测

通过 TargetScan（http：//www.targetscan.org）、mir DB（http：//mirdb.org）及PicTar（http：//pictar.bio. nyu.edu）3种生物信息学软件预测 miR-203与RAB22A的靶向关系

1.5 荧光素酶实验

转染前24 h将MG-63细胞接种于24孔板中，分成3组，即突变型质粒组、野生型质粒组及阴性对照组，突变型质粒组共转染miR-203和突变型荧光素酶报告质粒pGL3-RAB22A 3’WT；野生型质粒组共转染miR-203和野生型荧光素酶报告质粒pGL3-RAB22A 3’UTR，阴性对照组共转染miR-203和对照荧光素酶质粒。24 h后使用双荧光素酶报告基因系统进行荧光活性检测。实验重复3次，6个复孔/次。以海肾荧光素光吸收值作为内参，数据计算方法：萤光素酶活性=萤火虫荧光素光吸收值/海肾荧光素光吸收值。

1.6 MTT实验

MG-63细胞以1×104个/孔接种于12孔板中，培养24 h后行相应的转染实验，在培养箱中分别培养0、12、24、48和72 h后添加5 mg/ml MTT溶液40 μl，孵育4 h后加入二甲基亚砜200 μl/孔，摇床上充分震荡。490 nm波长测定吸光度值。相对细胞数=实验组数值/对照组数值×100%

1.7 细胞划痕实验

将miR-203组和Scramble组、RAB22A组和NC 组MG-63细胞用RPMI 1640（含10%胎牛血清）培养在6孔板上，待融合后，用灭菌枪头划直线，划痕后0～24 h，用反转的Olympus IX50显微镜通过10倍物镜和Image-Pro Plus软件捕获测量划痕面积，实验重复3次，划痕面积越大，表示迁移能力越弱。

1.8 Western blot检测

培养24 h后消化细胞，提取细胞总蛋白，蛋白变性、上样，每泳道上样量为50μg蛋白。50V、100mA电泳2 h结束后，聚偏氟乙烯膜转印。脱脂奶粉液封闭2 h。三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水清洗，分别加入RAB22A一抗（1∶200）、E-cadherin一抗（1∶200）、N-cadherin一抗（1∶200）、Vimentin一抗（1∶200）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗（1∶200），二抗浓度1∶1000，增强化学发光法显影。用软件Image J测量Western blot相关条带进行定量。目的蛋白的相对数值=目的Western blot定量数值/GAPDH Western blot数值。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，用Graphpad 6.0统计作图软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组比较用t检验，多组间比较用方差分析，若方差齐则两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-203在骨肉瘤及正常成骨细胞系中的表达

qRT-PCR结果显示，正常人类成骨细胞系hFOB 的miR-203相对表达量为（1.0±0.09），miR-203在骨肉瘤细胞系SAOS-2的相对表达量为（0.32±0.07）, miR-203在SOSP-9607细胞系的表达量为（0.30± 0.05），miR-203在U2OS细胞系的表达量为（0.26± 0.05），miR-203在 MG-63细胞系中表达量为（0.15±0.04），经方差分析，差异有统计学意义（F= 3.841，P=0.037）；进一步两两比较结果，骨肉瘤细胞系SAOS-2、SOSP-9607、U2OS及MG-63细胞系中miR-203相对表达量低于人正常成骨细胞系hFOB。见图1。

图1 miR-203在骨肉瘤和成骨细胞系中的表达

2.2 过表达miR-203抑制MG-63细胞的增殖和迁移

转染miR-203 mimics后，miR-203组miR-203相对表达量为（9.3±0.3），Scramble组miR-203相对表达量为（1.5±0.2），经t检验，差异有统计学意义（t=37.469，P=0.021），miR-203组miR-203相对表达量高于Scramble组（见图2A）。MTT结果示，在培养48 h后，miR-203组相对细胞数为（1.2±0.1），Scramble组相对细胞数为（2.5±0.2），经t检验，差异有统计学意义（t=-10.069，P=0.019）；培养72h后，miR-203组相对细胞数为（2.1±0.2），Scramble组相对细胞数为（3.3±0.2），经t检验，差异有统计学意义（t=-6.736，P=0.001），miR-203组相对细胞数少于Scramble组（见图2B）。培养24 h后，Scramble组细胞相对划痕面积为（25.4±4.3）%，miR-203组细胞相对划痕面积为（81.5±6.3）%，经t检验，差异有统计学意义（t=-12.739，P=0.031），Scramble组细胞相对划痕面积少于miR-203组（见图2C、D）。

图2 过表达miR-203抑制MG-63细胞增殖和迁移

2.3 miR-203靶向抑制RAB22A基因的表达

通过TargetScan预测miR-203和RAB22A基因3'端非翻译区的结合位点；构建野生型RAB22A 的3’UTR端、突变型的荧光素酶报告质粒及阴性对照荧光素酶质粒。野生型质粒组、突变型质粒组、阴性对照组的相对萤光素酶活性分别为（0.19±0.08）、（1.0±0.13）、（1.0±0.15），经方差分析，差异有统计学意义（F=4.753，P=0.025）；进一步两两比较，野生型质粒组与突变型质粒组、阴性对照组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=-8.252和-9.191，P=0.003和0.012），野生型质粒组荧光素酶活性低于突变型质粒组和阴性对照组（见图3A）。

图3miR-203靶向抑制RAB22A的表达

qRT-PCR结果显示，miR-203组的RAB22A mRNA相对表达量为（0.22±0.09），Scramble组相对表达量为（1.00±0.14），经t检验，差异有统计学意义（t=-8.117，P=0.025），miR-203组RAB22AmRNA相对表达量低于Scramble组（见图3B），Western blot检测显示，miR-203组RAB22A蛋白表达量为（1.38± 0.41），Scramble组表达量为（4.28±0.49），经t检验，差异有统计学意义（t=-7.861，P=0.012），miR-203组RAB22A蛋白表达量低于Scramble组（见图3C）。

2.4 过表达RAB22A促进MG-63细胞增殖和迁移

MG-63细胞系转染 pcDNA3.1-RAB22A后，RAB22A组RAB22A蛋白表达量为（8.20±0.48），阴性对照组为（1.1±0.18），经t检验，差异有统计学意义（t=23.988，P=0.039），RAB22A组RAB22A蛋白表达量高于阴性对照组（见图4A、B）。培养24 h后，RAB22A组细胞相对划痕面积为（18.4±2.3）%，阴性对照组为（41.5±5.9）%，经t检验，差异有统计学意义（t=-6.318，P=0.001），RAB22A组细胞相对划痕面积少于阴性对照组（见图4C、D）。MTT结果显示，在培养24、48和72 h后，RAB22A组相对细胞数分别为（2.3±0.16）、（2.8±0.23）和（3.5±0.31），阴性对照组相对细胞数分别为（1.6±0.13）、（2.3±0.19）和（2.9±0.23），两组24、48和72 h相对细胞数比较，经t检验，差异有统计学意义（t=5.881、2.902和2.692，P=0.002、0.021和0.027），RAB22A组相对细胞数多于阴性对照组（见图4E）。RAB22A组与NC比较，E-cadherin下调表达 [（0.18±0.09）vs（1.1± 0.15）（t=-9.109，P=0.000）]，N-cadherin上调表达[（4.6±0.73）vs（1.13±0.24）（t=7.821，P=0.000）]，Vimentin上调表达[（5.1±0.73）vs（1.09±0.19）（t= 9.207，P=0.000）]（见图4F）。

图4 过表达RAB22A促进MG-63细胞的增殖和迁移

3 讨论

骨肉瘤是好发于长骨端的恶性肿瘤，诊断主要依靠病史、检验结果及影像学资料。局部肿痛、跛行为骨肉瘤的常见临床表现，软组织肿块和骨皮质增生及特征性的Codmans三角为常见的影像学特征[9]。治疗方法包括手术、化疗、放疗及免疫治疗等。但骨肉瘤预后仍较差。据研究报道，年龄＜30岁的骨肉瘤患者5年生存率达60%，30～49岁的5年生存率达50%，＞50岁的5年生存率仅为30%[10]。近年来，一系列的医学研究指出，miRNAs在不同肿瘤组织中表达异常，并对肿瘤的发生有着重要的作用[5-8]。因此miRNAs被认为是一种潜在的肿瘤诊断与治疗的新靶标。近期报道指出，miR-203与乳腺癌、前列腺癌、食管鳞癌、膀胱癌,的增殖与迁移相关[6-8，11-13]。WANG等[6]报道，沉默miR-203可通过靶向BIRC5 和LASP1蛋白而抑制三阴乳腺癌增殖和迁移。miR-203被报道在前列腺癌组织中低表达，是抑癌基因，过表达miR-203可抑制前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭[7]。在食管鳞癌中，miR-203可通过Np63信号通路抑制食管鳞癌细胞增殖[8]。梁佳等[12]报道，miR-203在食管癌细胞及组织中呈低表达，呈高甲基化状态，且与TNM分期及组织分化程度相关。胡俊华等[13]报道，miR-203转染胃癌细胞系SGC7901后，侵袭能力减弱，凋亡增加，并通过靶向调控SNAI 2降低胃癌细胞侵袭能力，促进其凋亡。徐磊等[14]报道，miR-203可靶向调节Bmi-1基因，下调其表达，通过下调Bmi-1基因表达抑制H1975肺腺癌细胞株的侵袭转移，可作为一种潜在的抑制转移的分子。

本研究探讨miR-203对骨肉瘤细胞的增殖和迁移的影响及其调控机制，结果发现miR-203在骨肉瘤细胞系SAOS-2、SOSP-9607、U2OS及MG-63中呈显著低表达，说明miR-203在骨肉瘤细胞系中表达异常。这与miR-203在前列腺癌、乳腺癌等肿瘤中的表达情况相一致[6-8]。通过在MG-63细胞过表达miR-203，发现miR-203组的相对细胞数少于对照组，细胞划痕面积大于对照组，提示miR-203抑制MG-63的细胞增殖及迁移能力，与前列腺癌、食管磷癌及乳腺癌中的报道相一致[6-8]。

RAB22A是Ras GTP酶超家族成员[15]。有研究表明，RAB22A是一个原癌基因，并与多种肿瘤关系密切[16]。例如，RAB22A促进胃癌的增殖及侵袭[17]。本课题探讨miR-203对RAB22A基因的表达调控作用。实验发现，miR-203抑制RAB22A 3’UTR介导的萤光素酶活性，并下调其基因和蛋白表达水平。因此，miR-203能直接抑制RAB22A基因的表达，RAB22A是miR-203的直接作用靶标。进一步实验发现，RAB22A组MG-63细胞划痕面积低于对照组，相对细胞数高于对照组。因此，RAB22A过表达能促进MG-63的细胞增殖及迁移，进一步发现，RAB22A下调E-cadherin，上调N-cadherin和Vimentin基因的表达。因此，RAB22A能抑制MG-63细胞的上皮间充质转化。该结果与前述RAB22A在胃癌中的细胞调控功能相一致[17]。

综上所述，miR-203通过抑制RAB22A基因的表达，进而抑制上皮间质转化，而抑制骨肉瘤细胞的增殖及迁移。这是一种调控骨肉瘤细胞增殖与迁移的新机制，为骨肉瘤发病机制的研究提供新的线索。miR-203可望成为骨肉瘤诊断的一种潜在的生物标志物，并可能成为治疗的新靶标。

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（童颖丹 编辑）

Mechanism of microRNA-203 inhibiting proliferation and migration of osteosarcoma cells

Qing-hao Guo,Jun Cai,Shi-jiang Yang,Lin-tao Jiang
(Department of Emergency and Trauma Surgery,the Central Hospital of Wuhan,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, Wuhan,Hubei 430014,China)

ObjectiveTo investigate the potential role of miR-203 in the regulation of the proliferation and migration of osteosarcoma cells,as well as the regulatory mechanism.Methods The expression levels of miR-203 in the osteosarcoma cells and the normal osteoblasts were measured by RT-PCR.The MG-63 cell line was divided into miR-203 group transfected with miR-203 mimics,scramble group transfected with scrambles,RAB22A group transfected with pcDNA3.1-RAB22A plasmid and NC group transfected with blank plasmid by Lipofectamine 2000.The cell migration ability was measured by wound healing assay.Cell number was examined by MTT assay.The target relationship between miR-203 andRAB22Agene was predicted and verified by Target Scan software and double luciferase assay.The expression level ofRAB22AmRNA was measured by RT-PCR.The expression levels of E-cadherin,N-cadherin,Vimentin and RAB22A protein were measured by Western blot.Results Compared with the hFOB cells,the expression of miR-203 was significantly low in the osteosarcoma cell lines SAOS-2,SOSP-9607,U2OS and MG-63.MTT method showed that the number of MG-63 cells in the miR-203 group was significantly smaller than that in the scramble group aftercultured for 48 and 72 h (P＜0.05).After cultured for 24 h,the relative scratch area of the scramble group was significantly smaller than that of the miR-203 group(P＜0.05).TargetScan software and double luciferase assay verified the target relationship between miR-203 andRAB22Agene.The relative scratch area in the RAB22A group was significantly smaller than that in the NC group (P＜0.05).MTT method showed that the number of the MG-63 cells was significantly increased in the RAB22A group compared with the NC group after cultured for 24,48 and 72 h(P＜0.05).Compared with the NC group,E-cadherin expression was down-regulated,N-cadherin and Vimentin expressions were up-regulated in the RAB22A group.Conclusions MiR-203 inhibits proliferation and migration of osteosarcoma cells by inhibiting RAB22A gene expression and epithelialmesenchymal transition.

microRNA-203;RAB22A;osteosarcoma;proliferation;migration

R738.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.007

1005-8982（2017）06-0032-06

2016-09-27

蒋林涛，E-mail：lintaojiang99@21cn.com