木聚糖酶分子改造及工业应用研究现状

张燕青

（天津科技大学生物工程学院，天津 300000）

1 木聚糖酶的特性

1.1 诱导性

木聚糖酶主要是诱导酶。木聚糖酶的生产除了和菌株本身的特点息息相关，还与培养基中的诱导物密切相关。向基质中加入诱导物可以产生诱导效应或阻遏作用，并且一种物质对于某一微生物生产木聚糖酶具有诱导活性，但对于另外一微生物可能是抑制剂。研究表明，木聚糖自身是绝大部分木聚糖酶菌株的有效诱导剂。此外，某些小分子物质如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、乳糖等对不同菌株产酶的影响不同，例如葡萄糖、木糖对于一些菌株的产酶过程是诱导剂，而对于另一些菌株却有明显的阻遏作用。

1.2 耐热性

来源不同的木聚糖酶的组成和性质差别很大。例如来源于细菌和放线菌的木聚糖酶最适温度在50～60℃，真菌木聚糖酶的最适温度约为50℃，其耐热性比细菌来源的木聚糖酶差，嗜热微生物能产生耐高温木聚糖酶，更有利于某些工业化生产过程。比如制浆过程是用高温蒸煮方法除去木屑中的木质素。因此，用于纸浆漂白的木聚糖酶应该是耐热的。

1.3 耐酸碱性

来源不同的木聚糖酶最适pH和pH的稳定范围也各不相同。一般来说，来源于真菌的木聚糖酶为酸性木聚糖酶，最适pH为4.0～6.0；细菌和放线菌的木聚糖酶为中性或碱性木聚糖酶，pH稳定性较真菌高，稳定在6.0～8.0，而极端微生物则能产生适宜于特殊环境的木聚糖酶。现已有一些嗜酸性和耐碱性细菌的木聚糖酶基因通过载体构建以及受体菌的选择获得高效表达。

2 人工改良酶分子的方法

鉴于其高效专一的催化特性，生物酶制剂已成功应用于医药、化工、食品、新能源开发及环保等领域，然而某些生产过程工艺环节复杂，对酶特性有严格要求，甚至需要高盐、高温、强碱、强酸、有毒介质、非水相等特殊反应体系，而自然界中的天然酶对外界条件较敏感极易失活。

为了获得酶学特性优良的酶制剂，研究不断改进人工改良酶分子的方法。由于改进常规的诱变育种方法难以在短期内达到预期目标，操作过程危险，因此逐渐被基因工程或蛋白质工程技术取代。目前，人工改良酶蛋白质分子主要通过理性设计、非理性设计及介于两者之间的半理性设计来实现。

2.1 理性设计

根据已有信息通过改变或修饰酶分子中的个别氨基酸残基，而产生具有预期新功能的酶分子突变体的方法，即为理性设计。然而理性设计需要对所研究的蛋白酶分子进行较全面了解，只有在掌握大量信息的前提下才能做出具有实用性改造方案。经过大量的积累蛋白质分子结构与功能等相关方面的信息才能有目标的选取突变位点并对其作出改造。理性设计不仅需要对酶分子的三维结构进行透彻的解析，而且还需要熟悉酶分子的一级结构与立体结构间复杂的对应关系，并作出合理判断。此外，经修饰导致的特定区域内某氨基酸残基改变而导致的蛋白质构象的改变往往不能通过计算机辅助预测。但是随着研究的进一步发展，理性设计在分析和分子模拟对接的基础上，找出酶结构上的关键位点进行相应改造，目标更为明确，操作相对简单，理性设计必将成为酶改造的主流方案。

2.2 非理性设计

通过随机突变、基因重组等方法得到突变体库，然后采用定向筛选方法得到所需酶分子的方法，即为非理性设计。非理性设计无需了解酶蛋白分子准确结构及其他方面的相关信息。但此方法突变较为随机、试验周期长、工作量较大、筛选获得目的菌株几率低。

2.2.1 提高酶分子应用性能的改造方法

酶的体外定向进化即为分子进化，人为模拟随机突变、重组和自然选择等自然进化机制，创造体外特殊条件，随机诱变酶基因，用高效简洁的筛选方法定向选出所需的突变酶。如易错PCR、DNA改组、串联重复插入（TRINS）、体外随机引发重组（PRP）、临时模板随机嵌合生长（RACHITT）等。

易错PCR和连续易错PCR是改变普通PCR的反应条件（调整4种dNTP的比例、添加Mn2+、上调Mg2+浓度、使用较低保真度的Taq酶等）将碱基随机错配率相对提高，在原来序列上引入多点突变，构建质量高、容量大的突变库，利用简便的方法筛选出优质的目的突变体，此方法即为易错PCR。介于该方法只在单一分子内部发生遗产改变，因此称其为无性进化[1]。其耗时费力，故只用来对较小基因片段（＜800 bp）进行改造。通常经一轮的易错PCR很难筛选到满意的突变株，故需连续多轮易错PCR，该方法是将上一次易错PCR的有益突变基因片段作为下一次易错PCR的模板，依次循环连续地进行随机诱变，叠加每一次的有益突变而获得大幅度突变的结果。

DNA改组和基因家族改组是一种在体外进行的同源重组技术。对来源不同但功能相近的同源基因群进行改造，从而获得优势突变组合的蛋白质。基本操作流程：选定基因，经过随机突变生成带有不同突变的基因群，用DNaseⅠ随机切割，所得到的片段之间互为模板和引物进行多轮不添加引物的PCR，直至获得全长基因，最后加入依据完整基因两端序列设计的引物进行常规PCR，获得改组后的基因库。此方法能快速积累有益突变，具有理论和实际应用价值。基因家族改组利用DNA改组技术对在自然界进化上相关的一系列基因或基因家族进行同源改组。

串联重复插入（TRINS）是通过滚环复制的方式将原始基因以两个或多个序列串联的形式插入到目的基因中。TRINS模拟自然进化过程中的复制插入机制，当没有合适的高通量筛选时，TRINS的优势就显现出来。

交错延伸重组（STEP）将带有不同点突变的模板进行混合，合并普通PCR的退火和延伸两步为一步，进而缩短反应时间，合成非常短的新生链，此后再以这些新生链作为引物随机地杂交到含不同突变的模板上，继续PCR，反复进行该过程，结果会得到含有模板上间隔序列的新生的全长基因。从而得到新性质的酶。

临时模板随机嵌合生长（RACHITT）是把随机切割的基因短片段杂交到一个临时DNA模板上，排序后进行修剪重复、填补空隙和连接的方法。其中临时模板是一条间隔一定序列插入尿嘧啶的单链DNA，悬垂切割获得更短的片段，然后进行重组。

2.2.2 提高酶蛋白异源表达产量的分子改造方法

工业发酵生产酶蛋白产品，通常希望能尽可能的提高产品的表达量，从而降低生产和使用成本。基因工程的迅猛发展已使得很多蛋白质产品实现了工程菌株的异源表达，由于影响蛋白质异源表达的因素较多，微生物酶分子设计时需关注的一个重要方面就是要消除影响外源基因表达的诸多不利因素，从而提高表达量。可采取的策略有：密码子优化、调整GC含量等手段，改造信号肽，截断表达，融合表达等手段。

改造信号肽。需要被运输到特定位置的多肽都含有一段称之为信号肽的氨基酸序列，其将多肽引导至对应的位置。外源蛋白分泌至胞外，一方面消除对宿主细胞的正常生长代谢影响，另一方面避免宿主对目的蛋白的降解，此外还可以提高纯化效率。因此通过目的基因自身的信号肽或表达载体的信号肽实现分泌表达来提高外源基因的产量是比较可取的生产方式。合适的信号肽甚至可使分泌到胞外的目的蛋白含量＞分泌到胞外总蛋白的90%。对于某些难分泌的蛋白，则可尝试采用其他的信号肽，或者对原有信号肽进行改造[2]。

密码子优化和GC含量调整。不同物种由于表达系统缺乏识别某些密码子的tRNA而具有密码子偏爱性。如果外源基因中含有较多的宿主菌非偏爱型密码子，就会严重影响其在宿主菌中的表达。由于密码子的兼并性，故可在不改变外源基因氨基酸序列的前提下，优化外源基因，而提高外源蛋白的表达量。Mechold等将生物素酶BirA密码子进行优化后，发现其表达量提高5倍[3]。然而Wu等优化密码子后，在大肠杆菌中表达组蛋白和谷氧还蛋白发现产量并未有所提高[4]。四种脱氧核苷酸基因序列中的排布以及含量和比例可以影响目的蛋白在宿主中的表达量。Burland等发现，有些基因在毕赤酵母的表达系统中会导致转录的提前终止[5]。故为了保证表达效果需要进行GC含量调整，又要兼顾密码子偏好性。

截断表达。对于酶蛋白分子，其编码基因序列的有些区域并非酶活性所必须的特定的或随机截断某些基因片段，通过此种改造方法可改善酶学性质满足生产需要。其中截断位点可以是单一的，也有进行多位点截留的。通过随机截断从而构建出截断库，然后筛选得到目的突变酶。Hai等通过对来源于NE1的藻青素合成酶的截短研究表明，截去C端45个氨基酸后该酶仍然保留全酶的活性，继续向上截去一个氨基酸Glu865，则酶活全部丧失；由此得出Glu865是该酶活性中心的一个关键氨基酸，同时截断表达还可以协助研究酶特定氨基酸残基的功能[6]。

融合表达。双功能酶是一条多肽链，能同时催化两个不同的生化反应。由于反应发生在同一条肽链上，双功能酶通常催化效率比较高。双功能酶的出现对生命体的生存有着重要意义。目前普遍认为是在自然进化的选择压力下，编码功能相关蛋白的基因之间的融合而形成的[7]。这样功能相关的基因同位于一条肽链上即可享用同一套调控元件，能高效方便地调控蛋白质表达，还能拉进空间位置进而增强蛋白质间的互作。双功能酶通常由两个或多个结构域组成。研究表明从一株热纤维梭菌中分离得到一个由GH10家族木聚糖酶和酯酶组成的双结构域蛋白质[8]。

2.3 半理性设计

在酶分子基因序列比对分析的基础上，找出潜在的关键氨基酸残基位点进行定点突变，通过验证得到目标酶突变体，即为半理性设计。该方法相对非理性设计中的定向进化目标更明确、成功率也提高了，而且不需了解酶晶体结构，还避免了大量筛选工作，半理性设计改造策略成为酶分子改造的一种更合适的选择。

3 展望

前期的大量研究使得人们对木聚糖酶分子结构和酶学性质的相关性有了一定程度的了解，通过分子改造等生物技术得到了一些适合工业生产的改良蛋白酶，但还尚未形成系统的、具有指导性的、普遍适用的方法论。随着基因工程和蛋白质工程等高新技术的深入发展，科学的方法论体系必将在大量科研实践的基础上建成，从而创造出各行各业需要的性质优良的酶制剂。

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