miR-203靶向调控机制在妇科肿瘤中的研究进展

(山西医科大学第二医院，山西 太原 030001)

微小RNA(microRNA)是一类进化历程中高度保守的、小型非编码RNA，参与基因表达的转录后调控，在细胞凋亡、转移、上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、新陈代谢和血管再生等细胞事件中起重要作用。microRNA基因沉默受转化抑制和mRNA退化影响。RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)是由microRNA与Argonaute (Ago),GW182,and FXR1蛋白等结合而成，可与microRNA组装成miR-RISC,通过完全或不完全互补方式识别并结合到靶基因mRNA3′UTR(未翻译区)，进而降解靶基因mRNA或抑制其翻译表达,最终实现对靶基因表达水平的转录后调控[1]。miR-203 是近来研究发现的一种特异性上皮microRNA，定位于人染色体14q32-33上。研究发现，miR-203在食管癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、膀胱癌等恶性肿瘤中呈低表达，而在胰腺癌、乳腺癌等肿瘤中呈高表达，提示在不同类型肿瘤中，miR-203可能发挥着促癌或抑癌截然相反的作用。生物信息学数据库分析研究证实，miR-203的下游调控具有多靶向性特点，其与靶基因间存在一对多、多对一的对应关系,并构成复杂的网络调节通路,最终实现对肿瘤细胞分化、迁徙、侵袭、转移等生命活动的调控。现本文拟从miR-203在妇科肿瘤中的下游靶向调控机制作用、EMT等方面进行综述。

1 miR-203靶基因及其靶向调控通路

miR-203的靶向调控下游信号通路极其复杂，其靶基因产物主要包括转录因子、分泌蛋白、受体、转运蛋白等。根据生物信息学数据库分析软件(TargetScan、PicTar和MiRanda等)，分析MiR-203可能的下游靶基因包括：MEKK1基因、SNAI2基因、ZEB2基因等。大量研究资料表明，靶基因异常表达与上游miR-203的表达失调相关，miR-203启动子区甲基化异常及其他原因可导致miR-203的表达失调，进而启动并激活对应靶向下游信号通路，最终导致肿瘤的发生、发展。

1.1 miR-203靶基因MEKK1

高丽、卞卡等[2]利用Lv-MicroRNA-203转染下咽癌细胞Fadu，获得miR-203高表达的Fadu-Lv-MicroRNA-203实验组，而慢病毒Lv-luc转染的Fadu-Lv-Luc为阴性对照组，通过检测两组细胞株中MEKK1的mRNA及蛋白表达量，表明相较Fadu-Lv-Luc组，实验组MEKK1的mRNA及蛋白表达水平均显著下降(P<0.05)，最终结合双荧光素酶报告基因实验证实：MEKK1可作为miR-203的直接下游目标靶点，有可能受miR-203负向调控，抑制下咽癌细胞的转移能力。MEKK1(mitogen-activated protein kinase /ERK kinase kinase)是MAPK信号转导通路中的结点位置，其主要生物学作用与肿瘤细胞增殖、迁移、运动、侵袭等密切相关。MAPK通路是由MAPKKK、MAPKK和MAPK3个胞质激酶构成的多级联信号转导通路，代表一种Ser/Thr激酶家族, 将胞质蛋白磷酸化并移至核内调控转录因子。而MEKK1是MAPKKK家族成员之一,具有Ser/Thr激酶活性, 其羧基端为催化结构域, 可以磷酸化与其结合的蛋白[3]。氨基端为调节结构域,介导蛋白(Tiam1、ArhGAP9、Cdc42等)之间的相互作用并影响其行为和功能。在其催化结构域附近含有一个Ras结合序列, MEKK1可通过GTP依赖方式结合Ras蛋白，调控恶性肿瘤细胞迁移、侵袭、远处转移等多种信号通路。

MEKK1在MAPK信号通路中作为上游活化剂，主要参与ERK1/2 、JNK 、p38 3条通路[4-6]，与众多蛋白相互作用，形成复杂的信号网络，激活并调节不同类型细胞的凋亡。MEKK1通过其催化结构域与ERK1的上游激酶MKK1相互作用，通过Ras-Raf-MEKK1途径磷酸化并激活ERK1/2,作用于Elk-1、C-myc、C-fos、C-Jun、ATF、NFkB和AP1等转录因子, 参与细胞增殖、分化、凋亡和恶变的生物学行为。MKK4作为JNK的上游激酶，充当抑瘤和转移抑制基因角色[7]。C-Jun作为JNK的直接靶点，参与组成AP1。而MEKK1能直接磷酸化并激活MKK4和激活AP1，进一步激活JNK信号通路，在细胞分化、细胞凋亡、以及肿瘤的发生与发展中起重要作用。另外，MEKK1可通过激活p38的直接上游激酶MKK3而激活p38通路，在肿瘤转移和耐药等方面起重要作用。MEKK1的过表达可导致ERK1/2、JNK和p38通路的强烈激活,使肿瘤细胞发生异变。目前尚未在妇科肿瘤中发现miR-203靶向调控MEKK1基因，因而，可作为全新的靶向目标，从分子生物学更加深入的研究以及论证。

1.2 miR-203靶向锌指转录因子调控EMT信号通路

1.2.1 SNAI2转录因子 SNAI2属于锌指转录因子snail超级家族成员之一，定位于人染色体8q11.21，包含特异性的锌指结构域和SNAG结构，主要介导转录抑制，是重要的EMT锌指转录阻遏蛋白。EMT是指上皮细胞丢失细胞间紧密和粘附连接，失去细胞极性，向间质细胞表型转变，并获得更强的迁移、侵袭、增殖及抗调亡能力的过程[8]。肿瘤细胞可以通过特异性分化激活与EMT有关的生物路径，从而获得侵袭和转移的能力。廖红展等[9]通过miRNAs靶基因预测数据库分析并结合双荧光素酶实验证实：在胶质瘤细胞中SNAI2锌指转录因子3′-UTR可与miR-203 5′端碱基互补结合，可能作为miR-203的靶向目标基因，受其调控。利用胶质瘤细胞U251AR转染miR-203 mimics，上调miR-203的表达，而U87转染miR-203 antagomirs下调miR-203的表达，通过检测两组细胞株中SNAI2表达水平，表明SNAI2在U251AR细胞表达显著下调(P<0.05)，而U87细胞中SNAI2表达显著上调(P<0.05)。最终证实：miR-203可靶向调控SNAI2的表达，高表达miR-203可下调SNAI2的表达，遏制胶质瘤细胞的侵袭和迁移，逆转其EMT特性。

1.2.2 ZEB2转录因子 ZEB2为E盒结合锌指蛋白(ZEB)家族成员之一，由人染色体2q22上的ZFHX1B基因编码，是特异序列的DNA结合转录因子，作为多锌指蛋白质，其每个锌指结构都能独立与目的基因的受调节区域中的5′-CACCT(G)序列相结合，从而产生基因调控作用。ZEB2是上皮-间质过度的重要介质，参与调控细胞上皮间质转化(EMT)的过程，与EMT相关蛋白E-钙粘蛋白( E-cadherin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)在肿瘤细胞的黏附、转移及耐药中起着重要的作用。段训凰、姜靖雯等[10, 11]通过检测肺腺癌细胞A549和SPCA-1细胞株中miR-203、ZEB2、E-cadherin等的表达水平，表明过表达miR-203可抑制ZEN2的表达，同时促进E-cadherin的表达。而加入miR-203 inhibitor可逆转过表达miR-203细胞的ZEB2上调和EMT相关蛋白的改变。最后通过双荧光素酶报告基因证实miR-203可直接靶向作用于ZEB2的3′UTR，抑制调节ZEB2的表达，进而抑制细胞EMT进程。

1.3 SNAI2及ZEB2与EMT相关蛋白E-cadherin

1.3.1 SNAI2与E-cadherin 肿瘤的侵袭、转移能力依赖于肿瘤细胞与人体内环境各种生长因子、信号通路、生物蛋白(E-cadherin、LRIG1、TGFβ等)之间的相互作用。在EMT进程中，肿瘤细胞可获得渗透到周围正常组织的能力，并开始转移和抵抗化学疗法。其中，肿瘤生长因子TGFβ是EMT的多能性关键调节器，而E-cadherin可谓是其下游通路的关键蛋白，作为细胞间的主要黏附分子以维持上皮细胞极性和组织结构，是上皮细胞EMT的特征性标记。E-cadherin缺乏驱动EMT和癌症的侵袭和转移。KondratyevaL.G等[12]通过Western blot检测胰管腺癌细胞系PANC1(TGFβ1刺激组、TGFβ1未刺激组)中SNAI2与E-cadherin的表达，结果表明：相较TGFβ1未刺激组，TGFβ1刺激组中SNAI2表达明显上调，而E-cadherin表达明显下调；E-cadherin的显著减少是EMT发生的关键。E-cadherin明显下调可增强细胞EMT性，使其转移与侵袭能力显著提高。

1.3.2 ZEB2与E-cadherin Galván J A[13]通过检测胰腺导管腺癌(pancreaticductal adenocarcinoma，PDAC)肿瘤细胞、肿瘤萌芽细胞和肿瘤间质细胞中E-cadherin与Zeb1、Zeb2的表达，论证PDAC发生上皮间质转化(EMT)的过程。结果表明：与PDAC肿瘤细胞相比，PDAC肿瘤萌芽细胞中Zeb1、Zeb2(P<0.0001)呈高表达，而E-cadherin(P<0.0001)呈低表达；Zeb2在PDAC肿瘤基质细胞中，尤其伴有淋巴侵犯和淋巴转移者，呈超表达。最终证实在典型的有侵略性的PDAC肿瘤微环境中，PDAC肿瘤萌芽细胞不仅表达与上皮间质转化相关的mRNA水平印记蛋E-cadherin，突显出EMT特性，更是被表达高水平的E-cadherin遏制物Zeb1、Zeb2的PDAC肿瘤基质细胞所包绕，体现出一种与EMT型的肿瘤-发芽相关的超强关联。胡洁等[14]通过采用SP法检测胆管癌及癌旁组织中E-cadherin和Zeb2的表达，亦表明：Zeb2和E-cadherin在胆管癌组织中阳性率分别为34.92%和50.79%，而在癌旁组织中阳性率分别为10.71%和100%，二者呈明显负相关性。

2 miR-203与妇科肿瘤

2.1 miR-203与卵巢癌

miR-203与妇科肿瘤关系重大，在宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫内膜异位症等妇科肿瘤中表达异常。Guannan zhao等[15]通过研究卵巢癌细胞中的miR-203的表达及其功能发现，miR-203的表达与SNAI2的表达呈负相关性，即miR-203表达上调的卵巢癌细胞中，SNAI2表达同样下调。利用miR-203转染卵巢癌细胞株SKOV3和OVCAR3，作为高表达miR-203实验组，而转染空载体的SKOV3和OVCAR3细胞株为对照组，采用蛋白印记法分别检测两组SKOV3和OVCAR3细胞株中SNAI2和E-cadherin表达，结果表明，与对照组相比，实验组中SKOV3和OVCAR3细胞株中SNAI2表达均明显下调，而E-cadherin表达均显著上调；而进一步通过皮下注射上述两组SKOV3和OVCAR3细胞株建立小鼠模型移植瘤，检测小鼠移植瘤切片组织中SNAI2和E-cadherin表达，结果显示：相较转染空载体的小鼠移植瘤组，SNAI2在高表达miR-203的小鼠移植瘤切片组织中显著下调，而E-cadherin表达明显上调，二者呈明显负相关性。最终证实：高表达miR-203可沉默SNAI2的表达，进而促进E-cadherin表达，使细胞的迁徙、侵袭能力明显降低，抑制卵巢癌的EMT特性。

2.2 miR-203的靶向目标ZEB与宫颈癌

You Bo Ra等[16]通过研究ZEB对HeLa宫颈癌细胞生长和死亡影响发现，在DNA流式细胞实验中，随着cdk2、cyclin蛋白水平升高，一定量的ZEB(70-150uM)可诱导细胞周期S期停止，同时诱导细胞凋亡，而ZEB治疗细胞(包括HeLa细胞)中，S阶段的逮捕是抑制癌症生长的机制。ZEB可通过细胞周期阻滞和细胞凋亡抑制HeLa宫颈癌细胞生长。汪泉等[17]通过检测鳞状宫颈癌组织早期(B1、B2)、晚期(C1、C2)及癌旁组织中ZEB2和E-cadherin蛋白表达，对患者临床资料进行回顾分析，结果表明，宫颈癌组织中ZEB2阳性表达率明显高于癌旁组织(χ2= 11.35，P<0.05)，相较早期宫颈癌组织，ZEB2蛋白表达程度在晚期宫颈癌组织中明显增高；相反，癌组织中E-cadherin阳性表达率明显低于癌旁组织(χ2= 12.43，P<0.05)，证实：ZEB2蛋白具有抑制E-cadherin蛋白作用。而logistic回归分析显示：ZEB2和E-cadherin蛋白与宫颈癌组织的FIGO分期、分化程度和淋巴结转移情况有关联。高表达ZEB2诱发E-cadherin蛋白低表达，增加了宫颈癌细胞扩散转移率。

2.3 miR-203的靶向目标ZEB与子宫内膜癌

Howe Erin N等[18]通过研究miR-200家族与子宫内膜癌细胞和乳腺癌细胞的侵袭性行为中作用，发现miR-200家族成员可直接靶向瞄准、促进ZEB1和ZEB2，从而抑制E-cadherin，使上皮细胞发生间质过度。以子宫内膜癌细胞为例，与非侵略性的1型子宫内膜癌细胞系Ishikawa相比，侵略性的2型子宫内膜癌细胞系Hec50和AN3CA中上皮标记物E-cadherin消失，而间质标记N-cadherin和波形蛋白获得，体现出明显的EMT性。而在妇科肿瘤中，miR-203是否靶向调控ZEB2及其下游蛋白E-cadherin有待大量分子生物学实验进一步证实。

3 结语与展望

综上所述，miR-203广泛参与肿瘤细胞的分化、凋亡、EMT、迁徙、侵袭和远处转移等多种生物学行为，其分子生物学研究证实miR-203可能发挥促肿瘤细胞转移特性。在妇科恶性肿瘤和其他肿瘤中，miR-203可直接靶向调控其靶基因MEKK1、SNAI2及ZEB2等，通过其复杂的信号通路发挥作用。而且，miR-203及其靶基因相关蛋白E-cadherin，特定于恶性肿瘤的EMT信号网络，可作为一种新的肿瘤学标记物，有望成为评估妇科肿瘤恶性程度的重要指标，用于其早期诊断、疗效评估及预后监测，亦可作为治疗妇科肿瘤的全新药物目标。然而，miR-203及其靶基因相关蛋白表达的筛选、检测手段、检测成本等亦是一个需要关注的关键问题。总体来说，miR-203的靶向调控机制仍需大样本量的临床资料和检测技术手段加以论证，其在妇科肿瘤恶性度的评估预测、靶向分子药物治疗和诊疗预后等方面帮助极大。

[1] LEWKOWICZ P,CWIKLINSKA H,MYCKO M P,et al.Dysregulated RNA-Induced Silencing Complex (RISC) Assembly within CNS Corresponds with Abnormal miRNA Expression during Autoimmune Demyelination[J].J Neurosci,2015,35(19):7521-7537.

[2] 高 丽,卞 卡.MicroRNA-203对人下咽癌细胞转移能力的影响及其机制研究[J].局解手术学杂志,2015,24(03):241-244.

[3] SUDDASON T,GALLAGHER E.Genetic Insights into Map3k-dependent Proliferative Expansion of T cells[J].Cell Cycle,2016,15(15):1956-1960.

[4] YUE J,LOPEZ J M.JNK does not Regulate Meiotic Progression in Xenopus oocytes:The strange case of pJNK and pERK[J].Dev Biol,2016,416(1):42-51.

[5] SIPTHORP J,LEBRAUD H,GILLEY R,et al.Visualization of Endogenous ERK1/2 in Cells with a Bioorthogonal Covalent Probe[J].Bioconjug Chem, 2017, 28(6): 1677-1683.

[6] ZYUZ'KOV G N,DANILETS M G,LIGACHEVA A A,et al.PI3K, MAPK EPK1/2 and p38 are Involved in the Realization of Growth Potential of Mesenchymal Progenitor Cells under the Influence of Basic Fibroblast Growth Factor[J].Bull Exp Biol Med,2014,157(4):436-439.

[7] OWEN G R,ACHILONU I,DIRR H W.High Yield Purification of JNK1beta1 and Activation by in Vitro Reconstitution of the MEKK1-->MKK4-->JNK MAPK Phosphorylation Cascade[J].Protein Expr Purif,2013,87(2):87-99.

[8] ALKATOUT I,HUBNER F,WENNERS A,et al.In Situlocalization of Tumor Cells Associated with the Epithelial-mesenchymal Transition Marker Snail and the Prognostic Impact of Lymphocytes in the Tumor Microenvironment in Invasive Ductal Breast Cancer[J].Exp Mol Pathol,2017,102(2):268-275.

[9] 廖红展.锌指转录因子SNAI2在miR-203的影响下通过上皮间质转化参与胶质瘤耐药机制的调节[D].广州：南方医科大学,2015.

[10] 段训凰.miR-203和ZEB2直接相互作用抑制EMT信号通路减少肺腺癌化疗耐药[D].广州：南方医科大学,2016.

[11] 姜靖雯,陈学武,方唯意,等.miR-340通过下调CCND1表达增加结直肠癌细胞对5-Fu的耐药[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2017,24(5):467-471.

[12] KONDRATYEVA L G,SVESHNIKOVA A A,GRANKINA E V,et al.Downregulation of Expression of Mater Genes SOX9,FOXA2,and GATA4 in Pancreatic Cancer Cells Stimulated with TGFbeta1 Epithelial-mesenchymal Transition[J].Dokl Biochem Biophys,2016,469(1):257-259.

[13] GALVAN J A,ZLOBEC I,WARTENBERG M,et al.Expression of E-cadherin Repressors SNAIL,ZEB1 and ZEB2 by Tumour and Stromal Cells Influences Tumour-budding Phenotype and Suggests Heterogeneity of Stromal Cells in Pancreatic Cancer[J].Br J Cancer,2015,112(12):1944-1950.

[14] 胡 洁,边立会,王晓玉,等. 胆管细胞癌中CtBP1、Zeb1、Zeb2与E-cadherin蛋白的表达及临床意义[J/OL].临床与实验病理学杂志,2017,33(04):365-369.

[15] ZHAO G,GUO Y,CHEN Z,et al.miR-203 Functions as a Tumor Suppressor by Inhibiting Epithelial to Mesenchymal Transition in Ovarian Cancer[J].J Cancer Sci Ther,2015,7(2): 34-43.

[16] YOU B R,PARK W H.Zebularine Inhibits the Growth of HeLa Cervical Cancer Cells Via Cell Cycle Arrest and Caspase-dependent Apoptosis[J].Mol Biol Rep,2012, 39(10):9723-9731.

[17] 汪 泉.ZEB2、E-cad在鳞状宫颈癌细胞的表达与疾病分期的关系[J].上海医药,2014,35(21):49-51+57.

[18] HOWE E N,COCHRANE D R,RICHER J K.Targets of MiR-200c Mediate Suppression of Cell Motility and Anoikis Resistance[J].Breast Cancer Res,2011,13(2): R45.