RT-qPCR技术在法医病理学研究中的应用

杜思昊，李冬日，王慧君，王 起

（南方医科大学法医学院，广东 广州 510515）

RT-qPCR技术在法医病理学研究中的应用

杜思昊，李冬日，王慧君，王 起

（南方医科大学法医学院，广东 广州 510515）

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）是一种易操作且高效率检测组织或体液样本中mRNA的方法，具有操作容易、敏感性高、特异性强等特点。随着其在医学、生物学等领域的广泛应用，RT-qPCR技术在法医病理学领域的研究也得到一定发展。本文对RT-qPCR技术在法医病理学科研工作中的应用价值及现状进行综述，对国内外研究进展进行了回顾，并总结了实验过程中的检材提取、RT-qPCR实验及数据处理的注意事项，以期为法医学研究及应用提供参考。

法医病理学；逆转录聚合酶链反应；综述；实时荧光定量

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）是一项能高通量、高效率检测目的基因表达水平的技术。RT-qPCR的主要操作步骤包括总RNA的提取、质量检查、逆转录、定量PCR及数据分析，其主要原理即在逆转录酶的作用下以mRNA为模板合成cDNA的一条链，接着在DNA聚合酶的作用下进行扩增，期间通过qPCR仪检测荧光信号的变化情况并测定目的产物的含量，再根据标准曲线计算mRNA的含量或与内参基因含量比较后计算相对含量[1]。RT-qPCR技术于1992年由日本科学家Higuchi提出[2]，因其具有操作简便、效率高、特异性强等优点，目前被广泛应用在医学、生物学等多个领域中。

根据经典遗传学中心法则，控制生物遗传信息的DNA分子需要经过转录形成mRNA、翻译成多肽链，再进一步修饰成为有生物活性的蛋白质，因此mRNA的变化早于蛋白的表达变化。目前，RT-qPCR技术在法医病理学科研方面也获得了一定发展。

1 RT-qPCR技术在法医病理学工作中的应用价值与现状

法医病理学是研究与法律有关的伤、病、死及死后变化的发生发展规律的一门学科[3]。其主要工作内容即对尸体及器官组织进行检验，分析死亡原因，为案件的侦破提供医学证据。其需要解决的问题包括确定死亡原因、判断死亡方式、推断死亡时间、推断损伤时间、推断和认定致伤物以及个体识别等。当前法医病理工作者解决上述问题主要依靠的方法手段是现场勘验、尸体检验、组织病理学检验、毒（药）物检验等，并综合案情分析得出鉴定意见。而一些致伤因素（如中暑、冻死、中毒）导致的死亡或缺乏典型形态学改变的疾病（如急性心肌缺血、内分泌系统等）导致猝死的鉴定，仅利用传统的法医病理学方法进行鉴定相对困难。因此，近年来国内外学者将分子生物学技术应用到法医病理学工作与研究中，利用法医尸体解剖时提取的组织和体液等进行RT-qPCR检测来协助分析死亡原因、推断死亡时间、损伤时间等，RT-qPCR技术正逐渐成为目前法医病理学研究的热点之一。

1.1 RT-qPCR技术在死亡原因分析中的应用

法医病理学的首要任务即确定死亡原因，而在一些缺乏特异性形态学改变的死亡案件中，若缺乏相关案情资料，传统的法医病理学检查方法有时难以发现特征性改变[3]。如在急性心肌缺血导致死亡的鉴定中，因缺乏典型的组织病理学改变，往往给诊断带来困难。XUE等[4]检测心肌中Cx43和ZO1的mRNA表达变化，结果显示，冠心病猝死组与对照组相比，Cx43和ZO1的mRNA表达明显降低，提示心脏性猝死者可能发生心律失常。WANG等[5]检测肺组织中水通道蛋白-1（aquaporin-1，AQP-1）和 AQP-5的 mRNA 表达变化，发现AQP-5在窒息组中显著降低，此改变可能因窒息过程中缺氧引起，有助于对窒息死亡案件进行鉴定。

由于不同案件的死亡原因、机制和过程各不相同，机体组织中分子水平变化也会随之改变，而常规组织病理学检验难以发现这些改变，因此检测相关mRNA的变化可以反映死亡机制和过程，辅助进行死亡原因推断。

1.2 RT-qPCR技术在推断死亡时间中的应用

死亡时间也称死后间隔时间（postmortem interval，PMI）。法医学中推断死亡时间具有十分重要的意义，对于分析案情、划定侦查范围、判断嫌疑人作案时间均有重要价值。但是，实际工作中受个体差异、周围环境、死后变化等各因素的影响，准确推断死亡时间仍是法医病理学的难点。国内学者[6-8]用RT-qPCR技术检测死后不同时间大鼠的脑和脾等器官中管家基因GAPDH及β-actin mRNA的水平变化，测定了管家基因在推断死亡时间中的变化情况，并检测了不同环境温度及湿度下mRNA降解的时序性，为死亡时间的推断提供了重要数据。他们的研究提示，采用管家基因作为推断死亡时间的研究对象，可以避免选用其他基因带来的个体差异，并且在脑、脾组织中GAPDH及β-actin mRNA稳定性较好，可有效地用于晚期PMI的推断。吕叶辉等[9]选取12例已知死亡时间的尸体脑组织，通过RT-qPCR技术检测8种基因mRNA表达，结果显示，利用β-actin mRNA表达推断PMI的误差率为24.6%，利用GAPDH mRNA表达推断PMI的误差率为41.0%。因此，β-actin mRNA变化与死亡时间相关性良好，有望成为早期PMI推断的辅助指标。

1.3 RT-qPCR技术在推断损伤时间中的应用

法医病理学上的损伤时间是指从受伤到死亡所经历的时间，推断损伤时间是法医病理学工作的难点与重点，传统的推断方法主要是依据损伤组织的大体形态和组织病理学改变。通过多种分子生物学技术，可以对损伤修复过程中特征性的分子水平变化进行研究。例如，在烧伤[10]和切创[11]的损伤时间确定上，均采用RT-qPCR技术检测皮肤内的细胞因子、趋化因子等标志物。在虐童案件中，皮肤烧伤时间的确定至关重要，KUBO等[10]研究了烧伤后伤口愈合过程中13个基因表达的时间变化，发现细胞因子、趋化因子、增殖因子及胶原蛋白等组合能准确估计烧伤年龄。 兔的切创模型中，白介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）、环氧合酶（cyclooxygenase，COX） 2 及单核细胞趋化蛋白 1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）mRNA在损伤前期有明显升高，有助于切创早期的时间推断[11]。国内有学者[12-13]制作大鼠骨骼肌挫伤模型，用RT-qPCR技术检测骨骼肌中7种候选基因在不同时间点的mRNA表达水平，显示其表达水平均与损伤时间有关；检测挫伤组织中兴奋性氨基酸转运体3（excitatory amino acid transporter 3，EAAT3）、SLC1A1 mRNA的表达，发现其表达在挫伤后4～8 h升高，随后逐渐降低，直至48h接近正常水平，说明编码结构蛋白的基因或执行基础功能的蛋白适用于损伤时间推断。有研究[14-17]发现，大鼠肌肉挫伤后组织内核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、细胞间黏附因子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、COX6C、腺苷酸琥珀酸裂解酶（adenylosuccinate lyase，ASL）的表达呈时序性变化，有望用于损伤时间推断。用RT-qPCR技术检测大鼠脑挫伤模型mRNA的表达变化特点，发现caspase-1和caspase-3在挫伤后表达增加，可辅助诊断1h～14d的脑挫伤，而NF-κB只能辅助确定脑挫伤形成时间，但不能作为判断脑挫伤程度的指标[18-20]。用RT-qPCR技术检测小鼠皮肤切创组织的CB2R mRNA变化特点，结果发现在小鼠皮肤切创愈合过程中CB2R的表达变化具有时间规律性，可为皮肤损伤时间的推断提供参考[21-22]。除切创、挫伤外，也有学者[23-25]对脊髓损伤和脑组织缺血模型应用RT-qPCR技术检测目的基因的变化，发现脊髓损伤后缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）基因表达开始升高，对组织和细胞起低氧保护作用。而脑组织缺血后脑红蛋白（neuroglobin，Ngb）mRNA的表达也呈时间依赖性变化，其表达的时序性规律有望用于法医学损伤时间推断。但上述研究主要集中在动物模型，人体组织的验证较少，其法医学价值尚需进一步挖掘。

1.4 RT-qPCR技术在推断死亡过程机体病理生理状态中的应用

死亡的过程和机制是法医病理学研究的难点，利用RT-qPCR技术分析尸体组织样本的mRNA变化来分析死亡当时的相关分子水平情况，从而有助于推断死亡当时的病理生理学状态。RT-qPCR技术可应用于组织损伤的病理学分析、局部缺血缺氧、中毒或因中毒导致组织损伤部位的炎症、对暴力或环境危害的反应、中毒继发的疾病等分析[26]。例如，CHEN等[27]发现死后肺质量与生存时间相关；ZHAO等[28]通过RT-qPCR技术研究发现死后肺组织中葡萄糖转运体1（glucose transporter 1，GLUT1）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） mRNA 表达量与存活时间相关，部分说明了死亡当时肺的病理生理学状态。WANG等[29]利用RT-qPCR技术对肺水肿机制进行研究，发现中暑死亡者的肺组织中基质金属蛋白（matrix metallo protein，MMP）、ICAM-1、紧密连接蛋白（claudin，Cldn）5的表达均升高，而冻死者肺中只有MMP9的表达升高，提示细胞外基质破坏、炎症反应、紧密连接改变等多种机制参与中暑死亡者肺水肿的发生和发展，而这些分子的变化情况也有助于中暑死亡的辅助诊断。

WANG等[30]研究损伤与肺水肿的关系，发现AQP与MMP的mRNA变化情况在外伤与心脏性猝死组的肺组织中有明显不同，提示不同类型外伤后肺水肿的发生和发展机制有差别；他们还研究了烧死者脑水肿的机制，发现AQP与MMP的mRNA变化情况与烧伤后脑水肿的发生也存在关系。CHEN等[31]用RT-qPCR技术检测急性心肌缺血心脏组织中脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）与心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）的含量变化，结果发现心脏死亡组左心室壁组织中ANP和（或）BNP mRNA的表达更高，显示心肌钠尿肽在心肌缺血死亡中的病理生理反应特点。因此，检测不同基因mRNA的表达水平，一方面可以用于分析死亡原因，另一方面也有助于加深法医病理学工作者对死亡过程的理解。

但是RT-qPCR技术在法医病理学中应用依然存在局限性，目前其准确程度尚需进一步验证。RT-qPCR技术对样品要求比较高，但法医病理学尸体检材往往都存在不同程度的自溶，这也是国内外使用RT-qPCR技术进行研究的对象主要集中于动物模型组织的原因，然而动物模型并不能完全代表人体组织检材的特点，因此针对RT-qPCR实验的各环节，法医病理学研究有其特殊需要注意的事项。

2 RT-qPCR技术在法医病理学中应用的注意事项

法医病理学检材由于受死后变化、个体差异、潜在疾病等因素的影响明显，在应用RT-qPCR技术时需要特别注意以下问题。

2.1 RT-qPCR技术对检材提取的要求

法医病理学鉴定材料主要是尸体组织样本，尸体腐败导致mRNA降解。任广睦等[8]对死后不同时间段大鼠脑组织中的GAPDH mRNA进行检测，显示不同脑区神经组织的GAPDH mRNA表达均与死后经过时间（死后即刻、1 d、5 d、9 d、12 d）有相关性；但不同脑区的mRNA降解速率不同。人体和动物试验可能存在差异，吕叶辉等[9]对早期死亡的人体脑组织内参基因的RNA进行检测，显示5S rRNA、miR-9和miR-125b等表达稳定，而GAPDH的误差率较高，可能与死后变化有关。VAN DEN BERGE等[32]对81例埋藏4～42年的尸体进行不同器官的DNA与RNA分析，发现DNA和RNA分子均能够保持较稳定的状态，其中大脑和心脏组织中RNA最为稳定，这一结果表明，即使是埋藏时间较长的尸体，也有可能进行分子病理学分析。

提取检材时应考虑后期检测的需要，尽量多留取。选取对照组时应注意详细审查案情及病历资料，选取无潜在疾病或药物干扰的案例。解剖中提取检材应使用洁净、无污染的器械，提取目标组织样本，大小不超过0.5cm×0.5cm，需要加入适量组织保存液进行RNA保护[33]。目前常用的组织保存液为RNA later，研究表明RNA later具有更好的保护作用，优于冷冻法[33]。

2.2 尸体检材进行RT-qPCR实验的注意事项

从检材中提取出高纯度、完整的RNA是RT-qPCR的前提。最常用的RNA提取方法包括Trizol抽提加乙醇沉淀法和试剂盒硅胶膜离心柱法[34-35]。Trizol抽提加乙醇沉淀法可以保留比较完整的RNA分子，但是步骤繁多，容易污染，影响纯度；试剂盒硅胶膜离心柱法往往只能留存大分子量的RNA，200nt以下的小分子量RNA容易被漏掉[36]。提取RNA最重要的指标包括浓度、纯度和完整度[37]。浓度、纯度的控制均按照RT-qPCR实验的常规要求；而RNA分子完整性指对RNA进行毛细管电泳时，以软件中的RNA完整性计数（RNA integrity number，RIN）进行评估[37]。 在尸体组织样本中，RIN往往较低，由于RT-qPCR实验十分灵敏，有少量合格的RNA也可以检出。

目前最常用于mRNA检测的荧光技术是SYBR®Green I和 TaqMan®探针[38-39]。 SYBR®Green I探针需要进行引物设计、合成、摸索PCR条件等，比较经济实惠；TaqMan®探针操作条件均已得到优化，简便易行，且结果稳定，但价格较贵。在使用SYBR®Green I法进行检测时，还需要注意溶解曲线的意义及形状。

2.3 数据分析

比较检材中mRNA的表达差异有绝对定量与相对定量两种方法。绝对定量即仅依赖Ct值，不考虑扩增效率对结果的影响。有研究[40-41]发现，不同样本的RNA组成不同，个体的逆转录抑制物差异造成扩增效率不足100%，因此应慎重使用绝对定量。相对定量即使用内参基因使结果标准化，从而消除非生物学变化对结果的影响。但传统的内参基因并不一定适用于所有的实验条件，KOPPELKAMM等[42]的研究指出，人体死后组织的内参基因建议至少选择4个以供筛选。WANG等[43]对几种不同内参在尸体材料中表达的情况做过相关研究，结果发现，实验中传统内参基因在法医病理学研究中并不完全适用，须使用多个内参基因以提高数据分析的准确性。在一项烧伤后脑水肿的分子病理学研究[29]中，使用不同的内参基因进行相对定量，结果发现，当使用GAPDH或B2M作为内参时，AQP和MMP的mRNA水平在烧伤组与对照组中有不同的结果。XUE等[4]研究发现，选用传统的管家基因GAPDH或ACTB与多选择的几个管家基因（EEF1A1、PPIA、TPT1和RPL13A）对心肌组织目的基因进行相对定量的结果也不同。DU等[44]在对甲基苯丙胺中毒死亡尸体组织进行研究，检测了脑中不同内参基因的稳定性，结果RPL13A、YWHAZ和GUSB用于肺组织的内参定量更为稳定。因此，尸体检材用于RT-qPCR时，应对不同的器官组织进行内参基因的筛选，避免单个内参基因造成的相对定量误差，考虑到时间和效率，建议选取3～4个内参基因为宜。

准确定量mRNA的表达丰度不仅需要高灵敏性的检测方法，而且还需要精确的数据分析方法。内参的选择对目的基因的表达矫正具有重要意义。

3 RT-qPCR技术应用前景及展望

当前国内外法医病理学者使用RT-qPCR技术主要应用领域依然是mRNA的表达分析，近年来也有学者开始利用RT-qPCR技术检测非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）。李文灿等[45]检测了大鼠心肌组织中的microRNA、18S rRNA的降解和死亡时间的相关性，发现microRNA可能与尸体腐败导致的降解相关，但在死亡早期（死后120 h）内microRNA-1-2含量保持稳定，提示死亡早期可以作为一个稳定的内参指标反映其他生物学标志物的变化。陈维忠[46]研究了创伤性脑损伤后，大鼠海马组织microRNA的表达变化与认知功能障碍的相关性，结果伤后海马microRNA表达与P300变化存在一定相关性，microRNA可能在脑损伤后遗留的认知功能障碍中发挥调控作用。有报道[47-50]发现，不同体液中microRNA的表达特异性也有差异，但是研究体液中microRNA的数量有限，而且采用不同的检测方法和分析模型，导致研究的结果不一致，重复性差。这些问题可以通过建立复合检测体系来解决。随着RT-qPCR技术的推广，相信未来mRNA和ncRNA在法医病理学中的应用会更加广泛。

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2016-11-07）

（本文编辑：黄 平）

Application of RT-qPCR in the Study of Forensic Pathology

DU Si-hao,LI Dong-ri,WANG Hui-jun,WANG Qi
（School of Forensic Medicine,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China）

Reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction （RT-qPCR） is a convenient and highly efficient method for the detection of mRNA in tissues or body fluid samples.It has the characteristics of easy operation,high sensitivity and specificity,etc.With a wide application in medicine,biology and other fields,RT-qPCR technique has made some progresses in the research field of forensic pathology.This paper reviews the application value of RT-qPCR in the study of forensic pathology and current situation,as well as the research progress at home and abroad reviews.It also summarizes the notes of samples extraction,RT-qPCR experiments and data processing,which aims to provide reference for the forensic research and its application.

forensic pathology;reverse transcriptase polymerase chain reaction;review;real-time quantification

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.05.017

1004-5619（2017）05-0526-06

国家自然科学基金资助项目（81401556）；广东省自然科学基金资助项目（2014A030310293）

杜思昊（1992—），男，博士，主要从事法医病理学科研、鉴定；E-mail：sihaodu@foxmail.com

王起，男，博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事法医学教学、科研和鉴定；E-mail：wangqi_legmed@126.com