猪场大肠杆菌灭活苗的制备与免疫效果观察

王富贵（山东省安丘市金冢子畜牧兽医管理站 262100）

猪场大肠杆菌灭活苗的制备与免疫效果观察

王富贵（山东省安丘市金冢子畜牧兽医管理站 262100）

本研究从惠丰猪场发病仔猪中分离到致病性大肠杆菌，并对血清型菌株O64、O9、O149进行培养，经甲醛灭活，以铝胶佐剂，制成灭活菌，经检验该疫苗合格，对同型菌的攻毒保护率80%。

大肠杆菌、仔猪、免疫

仔猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一组肠道传染性疾病，常见的有仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病三种，以发生肠炎、肠毒血症为特征，主要发生在0～70日龄的仔猪[1]。大肠杆菌属于条件性致病菌，当环境因素恶劣或机体抵抗力下降时，容易引发该病发生，尤其是冬季，天气寒冷，气温剧变，保温不良，空气流通不畅，更易引发此病，造成新生仔猪大批死亡或生长发育不良，严重影响养猪业的发展，给养猪户造成巨大的损失[2]。惠丰猪场，母猪群5500头，存栏量47000头，品种为长白、大约克和杜洛克, 年产仔猪约120000头。2015年该猪场猪群健康，年出栏量10万头，说明该猪场免疫程序在2015年前都对预防大肠杆菌病起到过一定的作用。2016年，该猪场突然暴发仔猪黄白痢病，主要表现为一窝仔猪出生时体况正常，于12h之后，突然有一两头表现全身衰竭，很快死亡。以后其他仔猪相继发生腹泻，粪便呈黄色浆状，含有凝乳小片。有的转为拉灰白色粘稠粪便为特征[3]，致使仔猪发育停滞、消瘦、抵抗力下降。惠丰猪场也曾用疫苗预防和药物治疗仔猪黄白痢，但效果不佳。为此，从该猪场分离筛选出致病性大肠杆菌株制成铝胶苗用于该猪场后，仔猪黄白痢得到有效的控制。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）用灭菌棉签从该场典型黄白痢病仔猪肛门拭取20个粪样，置无菌试管中作为病料。（2）麦康凯和伊红美蓝琼脂培养基(上海市医学化验所试剂厂)产品型号：20151224，20种大肠杆菌0抗原单价血清(中监所)，肠杆菌科生化编码鉴定管，铝胶佐剂(浙江省军区后勤部卫生防疫检疫所)产品型号：20160104。

1.2 试验动物

15～18日龄小鼠20只，健康家兔10只(杭州市萧山区兽医卫生防疫站)，免疫与非免疫2日龄仔猪各15只，妊娠母猪90头(惠丰猪场)均为3胎内的年轻母猪)。

1.3 纯菌株的制备

取病料分别于麦康凯和伊红美蓝琼脂平板划线，经37℃培养18～24 h后，从麦康凯琼脂平板上钩取单个粉红色、圆形、稍隆起、边缘整齐、表面光滑的中等大小菌落或从伊红美蓝琼脂上挑取紫黑色、带金属光泽闪亮的疑似菌落，涂片，革兰氏染色，油镜镜检。将检出两端钝圆的G﹣短小杆菌再接种于麦康凯琼脂培养基上培养，37℃培养18～24h，重复2～3次，确认无杂菌后后分别移至琼脂斜面上，作为纯菌种[4]。

1.4 菌种鉴定

1.4.1 生化试验 参考兽医微生物学及免疫实验指导的方法，将个菌株分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖等糖的发酵生化管中做糖发酵试验；同时菌株分别做三糖铁试验、枸橼酸盐利用试验、吲哚试验、V-P试验、M．R．试验、尿素酶试验，设对照组并记录结果。

1.4.2 致病性试验 将生化鉴定后的菌株分别接种于普通肉汤，37℃培养18h后备用。取15～18g健康小鼠10只，分成两组，试验组和对照组个5只小鼠，试验组每只小鼠腹腔注射0.2ml疑似分离菌株肉汤培养液，对照组不注射，两组隔离饲养观察，每6h观察小鼠情况，选择致病小鼠的大肠杆菌菌株为该场致病菌株[5]。

1.4.3 血清型鉴定 待检菌株的处理：将纯化的待检菌液涂布于普通琼脂平板上，于37℃恒温箱中培养18h后，用适量5g⁄L石炭酸生理盐水洗下菌苔，制成浓稠菌悬液；121℃高压灭菌2h，破坏K抗原后即为待检菌的O抗原，4℃保存备用[6]。血清学鉴定：按照鉴定血清说明书分别做玻板凝集和试管凝集实验，鉴定惠丰猪场猪大肠杆菌致病菌株血清型。

1.5 大肠杆菌灭活苗的制备

1.5.1 扩菌培养 用接种环分别钩取适量不同血清型的菌株，划线于营养琼脂平板表面，在37℃条件下培养24h后，以灭菌生理盐水洗下制成悬浊液[7]；再取悬浊液均匀涂布于营养琼脂平板表面，在37℃条件下培养24h，以灭菌生理盐水洗下菌落。分别置于灭菌瓶中，用麦氏比浊管法测定其含菌数，使各血清型的菌液含菌数相等[8]。

1.5.2 灭活 将不同血清型的菌株培养液混合，以灭菌生理盐水稀释至含细菌总数为200亿/ml。加入甲醛溶液使其在菌液中的最终浓度为0.5%，37℃灭活24～48h，其间振荡数次。再加入等菌液体积20%灭菌氢氧化铝胶，最后加入柳硫汞使最终浓度为0.01%，混匀、检验、分装。

1.6 惠丰猪场大肠杆菌灭活苗的检验

1.6.1 性状和无菌检验 肉眼直接观察灭活苗性状；混匀并取适量灭活苗，均匀涂布于麦康凯琼脂平板上，37℃培养72h后观察及显微镜检查。

1.6.2 安全性检查 取10只小白鼠，分别皮下注射菌苗0.5ml/只，连续观察7d；取10只家兔，皮下注射灭活苗2ml/只，观察7d，期间每4h测1次体温；妊娠母猪10头，产前15d，肌肉注射4ml/头，连续观察20d。

1.6.3 攻毒试验 随机选取免疫母猪和非免疫母猪所产2日龄仔猪各l5头，分别用制苗细菌悬液，按100亿/头进行攻毒，观察仔猪哺乳期内的生长情况，记录仔猪发生黄白痢的头数和死亡情况，测定其对仔猪的保护率。

1.7 灭活苗的应用试验

1.7.1 试验对象 惠丰猪场，选择健康的妊娠母猪80头，随机分为4组。

1.7.2 免疫方法 第一组用本灭活苗免疫，妊娠母猪产前40d和15d分别肌肉注射，4ml/头。第2组用本灭活苗免疫，妊娠母猪产前40d和15d分别肌肉注射，2ml/头。第3组用市售大肠杆菌多价灭活苗进行免疫作对照。第4组不免疫作为对照。

1.7.3 效果判定 每天观察试验母猪所产仔猪，记录哺乳期内仔猪黄白痢的发生情况和仔猪发育情况，综合判定灭活苗的免疫效果。

2 结果

2.1 糖发酵与生化试验结果

各菌均可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖 甘露醇，产酸产气；少数菌株发酵蔗糖，只产酸或产酸并产气；M．R．试验阳性；V-P试验阴性；产生靛基质；尿素酶试验阴性；硝酸盐还原试验阳性；吲哚试验阳性；枸橼酸盐利用试验阴性；三糖铁斜面、底层产酸变黄，有气体，无变黑现象。从惠丰猪场共分离到致病性大肠杆菌17株，用玻片凝集法进行血清型鉴定，结果为：O64(7株)，O9(4株)，0149(5株)，一株未知。

2.2 无菌检验

灭活苗静置后分层，上层为澄清液体，下层为乳白色沉淀物，振摇混匀呈均一浑浊液；麦康凯培养基上无菌生长。

2.3 安全性检查

试验用的10只小白鼠、10只家兔观察7d均无异常；产前15d妊娠母猪注射后部分母猪有一过性的厌食反应，注射部位轻微红肿，无其他不良反应，胎儿、新生仔猪在哺乳期内均正常。

2.4 攻毒试验

攻毒试验结果见表1。

由表1可以看出攻毒后免疫组新生仔猪在哺乳期内发病3头，其中2头死亡，死亡率和致死率分别为13.35%、66.67%；攻毒后对照组新生仔猪在哺乳期内发病13头，其中7头死亡，死亡率和致死率分别为46.46%、61.62%。对比差异显著，说明灭活苗对哺乳期内的新生仔猪具有较好的保护作用。

2.5 应用试验

惠丰猪场大肠杆菌灭活苗在猪场免疫试验结果见表2

表2说明4个组的临床发病及死亡情况，2组全期发病率为15.42%，较1、4组分别下降了8.46%和24.09% ，经X2检验组间差异显著(P<0.05)；2组全期死率为6.07%，较4组下降了10.51%，组间差异极显著(P<0.01)，较一和3组分别下降了3.88%和1.55% ，组间差异显著(P<0.05)，说明该灭活苗免疫效果良好。

3 讨论

3.1 试验结果分析

从应用试验结果可以看出：用4ml/头量本猪场大肠杆菌灭活苗时免疫效果较市售疫苗效果好，市售疫苗预防免疫接种效果较空白组也很明显的，故单从实验结果推断此次仔猪大肠杆菌病的暴发并非市售疫苗的质量问题。其发病原因可有以下可能：（1）预防接种时，疫苗剂量达不到标准,造成母猪抗体水平不高致使仔猪所获得的母源抗体水平也相对较低,不足以抵抗外界存在的病毒侵袭。（2）日常消毒工作不严格与外界环境隔离工作没做好，导致发病。（3）母猪营养水平低，新生仔猪吃初乳太迟或食入量太少，导致体内抗体水平低导致发病。四是自然界中大肠杆菌血清型(O抗原型)多达数万种，某一血清型的大肠杆菌的抗体对其相应血清型的大肠杆菌免疫效果最好，而对其它血清型的大肠杆菌免疫效果不一。

综上所述，本次惠丰猪场仔猪大肠杆菌病的暴发原因是多方面的，只有更加严格的执行好各种疾病的免疫程序，做好各种卫生消毒及管理工作，减少环境诱因和应激反应才能有效的预防各种疾病，给猪场带来更大的效益。

3.2 惠丰猪场发病的原因及补救措施

（1）仔猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一组肠道传染性疾病，严重影响养猪业生产的健康发展，对规模化养猪业的危害尤为严重[9]。但大肠埃希氏菌易产生耐药性，且常呈多重耐药，药物治疗费用较高且效果不佳，应该预防为主。大肠埃希氏菌的血清型较多，现发现的致病性大肠埃希氏菌血清型数量近百余种，不同地区猪场的菌型不尽相同，不同血清型菌株的抗原种类不同。因此，不同血清型之间的交叉免疫能力较弱，使用普通疫苗，往往因菌型差异起不到有效的预防效果，免疫结果很不理想。因此，从特定猪场分离出的致病性大肠埃希氏菌优势血清型菌株制成灭活苗，免疫该猪场妊娠母猪，可较好地预防仔猪黄白痢的发生，提高仔猪成活率，它克服了普通疫苗由于血清型差异而造成的免疫效果不佳[10]。（2）仔猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌感染所致，也与仔猪的抵抗力、环境及饲养管理密切相关。因此，除采用合适的疫苗及时进行免疫接种外，还应注意加强日常的卫生、饲养管理，减少环境诱因和应激反应；做好母猪产前补硒和仔猪产后补铁与补硒工作；确保保育舍内一定的保温和干燥效果；对已发病的猪应及时做好隔离消毒，及时治疗，达到综合防治的目的。

3.3 免疫接种的技术要求

（1）免疫接种前对使用的疫苗要逐瓶检查，检查瓶子有无破损，封口是否严密，瓶签是否完整，有效期是否已过，有一项不合格均不能使用，做报废处理。（2）接种疫苗必须由受过专业培训的兽医技术人员操作，按规程进行接种。（3）免疫接种用的器材(注射器、针头、镊子、稀释液瓶等)要洗净并煮沸消毒后方可使用。（4）稀释后的疫苗溶液要固定一个注射针头，避免反复吸取时污染疫苗，要求一猪更换一次针头。（5）接种疫苗时应检查和了解猪群的疫情，若有严重传染性疾病流行时，则应停止接种，若是个别病猪，应剔除，隔离，然后接种健康猪。（6）免疫接种后，特别是在1h内，应由专人认真的检查猪群中有无过敏或严重的应激反应，同时准备好肾上腺素等抗过敏药品，便于及时抢救。（7）注射疫苗前后10d，不应饲喂含抗生素的饲料或注射抗菌药物

4 结论

对从惠丰猪场发病仔猪分离到的致病性大肠杆菌血清型菌株O64、O9、O149进行培养，经甲醛灭活，以铝胶为佐剂，制成惠丰猪场仔猪大肠杆菌灭活苗(含菌量为200亿/m1)，该疫苗安全性检验合格，对同型菌株的攻毒保护率达80.00%，对仔猪黄白痢有较好的预防作用。

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