酶联免疫吸附法在畜产品兽药残留检测中的应用

刘维红 （山东省临沂市畜牧兽医检测中心 276000）

酶联免疫吸附法在畜产品兽药残留检测中的应用

刘维红 （山东省临沂市畜牧兽医检测中心 276000）

本文简要介绍了酶联免疫吸附法(ELISA)的原理与类型，概述了ELISA技术在兽药残留检测中的应用及ELISA操作过程中应该注意的问题。

兽药残留是“兽药在动物源食品中的残留”的简称，兽药残留是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及(或)其代谢物，以及与兽药有关的杂质。随着人们对食品安全的重视和对兽药滥用造成危害的认识加深，兽药残留分析现在已变得迫切和重要[1]。用于测定兽药残留的方法有很多，有高效液相色谱法(HPLC)、高效薄层色谱法(HPTLC)、气质联用法(GC-MS)、液质联用法(LCMS)、毛细管电泳-质谱法(CE-MS)[2]，这些方法对样品的前处理过程较繁琐，操作复杂，耗时长，难以满足现场快速测定样品的要求。酶联免疫吸附技术具有检测快速、灵敏度高、特异性强等特点，成为快速检测兽药残留的有效手段。

1 酶联免疫吸附法的原理与类型

ELISA是酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)的简称，是以免疫学反应为基础，将抗原抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种具有高特异性和高敏感性的实验技术[3]。ELISA法既可以用来测定抗原也可以用来测定抗体。常见的类型有：（1）双抗体夹心测抗原：此法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原；（2）双抗原夹心测抗体：此法中受检标本不需要稀释，可直接用于测定；（3）间接法测抗体此法主要用于传染病的检测。优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法；（4）竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不容易被除去或不容易得到足够纯度的抗原时，可用此法检测特异性抗体；（5）竞争法测抗原 此法多用于测定小分子激素或小分子药物；（6）捕获包被法测抗体 此法主要用于病毒性感染的早期诊断；（7）ABS-ELISA(亲和素-生物素系统-ELISA)由于此法较普通ELISA法多了两种试剂，增加了操作步骤，在实际检测中此法应用较少。

2 ELISA法在畜产品兽药残留检测中的应用

（1）兽药残留的特点是样品中残留物水平低，样品基质复杂，干扰物质多，不易从样品中分离纯化残留物，因此，兽药残留分析是复杂样品基质中痕量组份的分析技术。样品的分离纯化是兽药残留分析中最费时和和劳动强度最大的步骤[4]。但随着研究的深入和技术的完善，对样品的前处理由原样品的复杂处理与抽提发展为只需要高度纯化的过程，加速了其在实际检测中的应用[5]。（2）虽然ELISA技术具有高特异性和高灵敏性，但其对试剂的选择性高，很难同时分析多种成分，对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应。再加上大部分兽药为小分子量的药物(MW＜2500)，一般不具有免疫原性，很难刺激机体产生免疫反应。近年来随着小分子化合物免疫分析技术的发展，目前几乎所有常见的兽药残留都建立了ELISA检测方法，检测样本多样，主要有动物组织(包括肌肉、肝脏、肾脏等)、蛋、乳、蜂蜜、饲料、尿液、毛发等[6]。

3 ELISA操作注意要点

3.1 实验前准备

（1）试剂盒及实验过程中要用到的所有试剂要恢复至室温；（2）不同批次的试剂盒不要混用；（3）不用过保质期的试剂盒；（4）准备好实验过程中所用的吸水纸、移液器及吸头，检查酶标仪和恒温培养箱是否处于工作状态；（5）将所需的酶标板板条插入酶标板架上，将剩下未使用的板条用自封袋密封后，立即保存于2～8℃环境中；（6）各试剂在使用前要摇匀，混合时应避免气泡的出现；（7）检测时尽量减少酶标板上方空气的流动。

3.2 实验操作过程

3.2.1 加样 加样时注意要把所加物加到板孔底部，不可加在板孔上部，不可溅出，不可产生气泡。加样一般用微量加样器，每次应更换吸头，以免发生交叉污染。要注意加液量是否一致，避免多加漏加现象的发生。加完所有液体后注意液体的混匀。

3.2.2 温育 不同的试剂盒要求的反应温度、时间不同，温度过高过低或者是时间过长或过短都会影响最终实验结果，应注意温育的时间和温度应按规定力求准确。为保证时间准确，一个人一次不宜同时多于两块板操作、测定。

3.2.3 洗涤 洗涤虽不是一个反应步骤，但也决定着实验的成败，可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。ELISA就是通过通过洗涤来清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。倒掉板孔中液体，在每孔中加入规定数量的洗涤液，充分洗涤3～5次，每次浸泡15～30s，最后倒掉板孔中的洗涤液，应将酶标板倒置在干净的吸水纸上，拍干。

3.2.4 显色 显色是ELISA操作中最后的一步温育反应，此时是酶催化无色的底物生成有色产物的反应过程。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断。

3.2.5 读数 读数前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，但应尽量避免刮花表面。加完终止液后要混匀，要在规定时间内读数，液面不能有大的气泡。操作时室温最好在15～30℃之间，使用前先预热仪器15～30min，以使读数测定更稳定。

4 小结

目前，ELISA技术已被广泛应用于兽药残留分析中。在各种残留分析方法中，ELISA法作为一种最常用的免疫分析法，具有成本低、速度快、灵敏度高、仪器设备简单等特点，适合于大批量样品的快速分析，降低了检测成本，已成为兽药残留分析方法中不可或缺的一种方法。

[1] 潘孝成, 祁克宗, 孙国仁等. 兽药单克隆抗体研究进展[J]. 动物医学进展, 2005, 26(4)∶ 31-33.

[2] 黄雪英, 沈丹. 兽药残留检测技术应用现状及发展方向[J]. 中国兽药杂志, 2014, 48(7)∶ 66-69.

[3] 伏旭, 李培武, 贺莉等. 酶联免疫吸附法的应用研究进展[J]. 氨基酸和生物资源, 2012, 34(3)∶ 41-44.

[4] 张素霞. 兽药残留分析技术研究进展[J]. 动物保健, 2005(9)∶ 30-33.

[5] 万宇平. ELISA在兽药残留检测中的应用[J]. 动物保健, 2005(6)∶38-39.

[6] 张泽英. 酶联免疫分析技术在兽药残留检测中的应用[J]. 湖北畜牧兽医, 2013, 34(10)∶ 59-61.

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