多表位疫苗构建研究进展及其兽医临床应用

孙香丰 代灿灿 （青岛市动物园 山东 青岛 266000）

多表位疫苗构建研究进展及其兽医临床应用

孙香丰 代灿灿 （青岛市动物园 山东 青岛 266000）

多表位疫苗(multiepitope vaccine)也称鸡尾酒式疫苗，是一种基于目标抗原表位氨基酸序列设计的新型亚单位疫苗。根据设计方法不同，可分为线性串联多表位疫苗、多价抗原肽表位疫苗、病毒颗粒样疫苗等形式。根据抗原表位类型不同可分为B细胞表位疫苗、T细胞表位疫苗、混合型表位疫苗等。本文就近年来多表位疫苗构建研究状况和其在兽医临床应用作一综述。

1 表位的筛选和鉴定

（1）筛选、鉴定抗原表位是研制多表位疫苗的第一步。传统的表位筛选、鉴定方法有酶法(化学法)、噬菌体展示技术、MHC单链分子结合法、合成串联重叠肽法等。但这些方法操作复杂，费时费力成本高。所以，寻求高效低廉的表位预测方法一度成为研究的热点。（2）随着计算机技术和生物信息学的迅速发展，通过计算机预测、模拟表位成为高效低廉的替代或辅助方法。根据已有的表位数据，计算机对氨基酸、碱基序列进行分析，从中迅速预测、筛选出潜在的抗原表位。结合已知的抗原蛋白结构预测出线性和构象表位，并以直观图示出来。不过相比构象表位的预测，目前线性表位的预测结果更为精确和成熟。（3）在B细胞线性表位预测上，常采用的在线预测工具有Predicted Antigenic Peptides、BepiPred、ABCPred等。非在线预测工具中，以DNA Star软件较为通用，预测准确率可达到75%以上。这是基于对抗原性、亲水性、可折叠型、表面可及性、电荷分布、二级结构等参数的综合分析而得出的预测结果[1]。需要注意的是，无论采用何种预测工具，预测结果与实际表位间均有一定偏差。故而，在操作时常需将多种方法结合起来以求降低预测的失误率。（4）在T细胞线性表位预测上，基于细胞表面与MHCⅠ类分子结合的抗原表位能被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别，常用的在线预测工具有NetCTL、CTLPred等；基于诸如细菌、病毒抗原和免疫接种蛋白等外源蛋白经加工后与MHCⅡ类分子结合的抗原表位可被辅助T细胞(Th)识别，常用的在线预测工具有TEPITOPE、AMPHI等[2]。（5）目前，在线预测工具对MHC I类分子结合线性表位的预测比MHCII类分子结合非线性表位预测准确度高。此外，NetMHCpan、NetMHC对MHCI/Ⅱ结合表位综合预测也有较好的效果。

2 表位疫苗的设计

在二级结构角度，抗原表位多分布于β折叠和无规卷曲中。单个表位分子量小，缺乏稳定的立体构象，易被降解。多次免疫则容易造成免疫耐受[3]。基于此，表位疫苗的精心设计显得举足轻重。目前常通过多表位串联、MAP空间表位展示、脂肽模式等提高抗原抗体的亲和力、增加抗原的免疫原性与稳定性。

2.1 多表位的串联 多表位的串联可有效改善单个表位免疫原性弱，易降解的弱点，也能够避免引入表位载体带来的不确定影响。林祥梅等利用生物信息学软件对口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1-VP3上可能的抗原表位进行了预测分析，并从中选出8条表位多肽偶联载体蛋白进行合成后免疫小鼠。利用该病毒SATⅡ型阳性血清进行ELISA检测其反应原性。结果显示，上述多肽均能与该阳性血清结合，具有良好的反应原性，且其中有6组小鼠经免后产生了针对该表位多肽的抗体[4]。Alexanders等合成包括10表位的多肽免疫小鼠，检测发现诱导出了针对各表位的免疫应答。他进一步指出，只有30个以上的氨基酸组成的多肽才具有较好的免疫原性，这对串联表位的设计有一定指导意义[5]。

2.2 MAP空间表位展示 多聚抗原肽(multiple antigen peptides，MAP)能以较小的空间聚集高浓度的抗原表位，进而形成具有立体结构的表位簇，大大提升了多肽数目和免疫原性。徐小洁等用MAP免疫3只小鼠，抗血清滴度可达到1∶6400～12800[6]；吴姿蓉分别设计了来自疟原虫孢子阶段、肝组织和血液的三种疟原虫疫苗。然后分别在C57BL/6、BALB/c、A/J系小鼠，HLA-A2基因转导的C57BL/6小鼠和杂交品系(CD1)小鼠展开抗体和细胞免疫反应检测。发现这三种MAP疫苗均能诱导明显的体液和细胞免疫[7]。吴玉章等证实合成含有Pre-S2序列的MAP肽，经免小鼠后诱发的免疫反应比对照组线性肽强，表明MAP肽的结构与抗原肽的免疫原性呈正相关[8]。由于目前MAP空间表位展示能够使多表位有稳定的三维结构和较强的免疫原性，已开始应用于艾滋病病毒(HIV)、禽流感病毒(AIV)等病原体的新型诊断抗原和疫苗研究中，显示出了其独特的优越性。但不足之处是需化学合成赖氨酸骨架和纯化，制备困难，费用不菲[9]。

2.3 脂肽模式 将具有免疫佐剂活性的脂质分子上共价连接抗原表位肽而构建的疫苗称为脂肽模式疫苗。具有亲脂性且比较稳定的脂质分子可迅速被动跨膜将抗原肽导入胞内。进而在佐剂作用下激发机体产生强烈的免疫反应。Gallez-Hawkins认为脂肽疫苗在抑菌、治疗病毒感染及诱发粘膜免疫方面是理想的选择[10]；Nardin EH等用脂肽P3C(lipopeptide tripalmitoyl-S-glyceryl cysteine，P3C)核心作为内源性佐剂，通过肟键将B、T细胞表位与水溶性的脂肽P3C紧密连接，制成的聚肟疫苗具有四分枝结构，基于此，即便没有任何外源性佐剂，其依然具有良好免疫原性[11]。

2.4 旁侧序列的修饰 （1）引入间隔序列使表位和表位间有一定间隔，在保证表位独立性的同时又不产生新的表位，间接提高了蛋白酶的切割效率和抗原呈递效率。Livingston在表位间插入序列“GPGPG”的柔性肽消除了对表位呈递的影响，避免了在表位连接处新表位的形成，和对原有表位的影响[12]。Velders等实验证实，“AAY”氨基酸序列作为间隔肽，是蛋白酶优先切割位点，插入到表位间可提高表位被切割的效率[13]。（2）将通用T细胞表位引入多表位疫苗的侧翼序列中能相对减轻MHC分子限制性，进而在不同个体中诱导出免疫应答。石统东等在HBV治疗性多表位疫苗中引入“Th+B”细胞表位以及3个Ala间隔序列，发现针对CTL表位肽的免疫反应增强[14]。（3）MHC分子与表位的结合是特异性的，可以识别一系列具有某些共同特性的肽段，唐艳将黑色素瘤相关抗原MART1/Melan A(27-35)(AAGIGILTV)表位的P1位由L替换为A，提高了表位的免疫原性。所以，旁侧序列的修饰对于表位疫苗的研发有着重要作用[15]。

3 多表位疫苗载体的选择

单一的表位多肽分子量较小，免疫原性较差，缺少稳定的立体构象，易被降解，在实际中常需借助一定的载体才能更好的发挥免疫作用。载体的选择要安全有效，尽量不破坏原有构象或干扰抗原分子的空间结构。常见的载体有蛋白质载体、脂质载体和一些佐剂类。

3.1 蛋白质载体 （1）目前蛋白质载体使用最为广泛，其中以乙肝病毒核心蛋白(HBc)最具代表性。乙肝病毒的核心蛋白N端、C端和主要免疫显性区域 (MIR) 允许一定程度的缺失和外源插入，并且能够将外源序列重复且高密度地暴露在颗粒的表面，从而诱发强烈的外源序列特异的体液和细胞免疫反应[16]，这些特点为其作为蛋白质载体奠定了绝佳的基础。（2）Gregson AL等在HBc MIR区的78、79位氨基酸之间插入恶性疟原虫免疫显性B细胞表位[(NANP)3] 和一个人类白细胞抗原(HLA)限制性CD4+表位(NANPNVDPNANP)，并在HBc的149位氨基酸后融合一个通用T细胞表位(326-345AA)，从而实现了ICC-1132抗疟疾疫苗的研发成功，并于2008年完成在美国的I期临床研究[17]。截至目前，人们还发现了许多有病毒颗粒样结构(VLPs)的外源抗原表位表达载体系统，如重组杆状病毒中表达的HIV-1 gag蛋白载体系统、HBV核心抗原(HBcAg)和HBsAg载体系统、轮状病毒(RV)Vp6蛋白载体系统等。此外，牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)等大蛋白也可作为表位疫苗的蛋白载体。2000年以后，一些特定尺寸的纳米材料也在被尝试用作表位载体[18]。

3.2 脂质载体 脂质分子作为载体连接在抗原肽的末端，使抗原容易被递呈细胞识别，而且本身具有生物学活性，无毒性易降解。脂质载体不仅能避免表位降解而且能增强免疫应答反应。Kohyama等利用生物信息学软件预测出冠状病毒的非结构蛋白Nsp1a的T细胞表位，再将其偶联到脂质体后免疫小鼠，检测发现可诱导冠状病毒特异性的CTL细胞和记忆性细胞的产生[19]。

4 佐剂

氢氧化铝佐剂和弗氏(完全/不完全)佐剂和是目前常用的疫苗佐剂。Tigno Aranjuez等将两种MHC I类分子限制性的多肽经完全弗氏佐剂(CFA)乳化后免疫C57BL/6J小鼠，发现CFA作为佐剂能够诱导CD8+T细胞产生明显的增殖和迟发型变态反应，并能诱导产生γ-干扰素、IL-2和IL-17等[20]。Wang等报道将丙肝病毒抗原多肽与氢氧化铝佐剂混合免疫小鼠，诱导抗体效价可达到1∶51200，还能引起CD19+、CD38+、IL-6、IL-10等的产生[21]。

5 在兽医临床方面的应用

多表位疫苗在兽医临床预防、治疗病毒性疾病过程中有着重要作用。

5.1 禽流感病毒(AIV) 禽流感病毒囊膜蛋白可发生抗原漂移和重组，传统疫苗很容易无效，多表位疫苗可以克服这一缺点。李峥用原核表达禽流感病毒HA基因3个中和表位(HA92-105、HA127-133、HA183-195)的重组多表位肽，经免小鼠和兔子后均产生了高滴度的中和抗体[22]；Thomson构建了包含10个CTL抗原表位的真核重组质粒，质粒免疫小鼠后，这些表位使得CTL应答增强并对感染禽流感病毒有较强清除作用[23]。

5.2 口蹄疫病毒(FMDV) 邵军军等用化学法合成了FMDV VP1基因140-160及200-213位肽段基因片段，构建串联重复表位于IgG的重链恒定区，免疫仔猪30天后检测到高滴度的抗体，免疫效果良好。

5.3 水貂肠炎病毒(MEV) 卞大伟将预测筛选出得到CDV N、F、H蛋白和MEV VP2蛋白的5个优势B细胞线性表位洗牌重组，在表位间插入柔性肽间隔，原核表达重组蛋白免疫小鼠，HA-HI实验和Western Blot检验三免后血清，均产生高滴度抗体[25]。

6 面临的问题和展望

（1）疫苗接种是目前有效防控病毒性疾病的方式之一，常见的灭活疫苗和弱毒活疫苗有着一些难以克服的弊端，诸如热不稳定性、毒力返强返祖、体外培养困难、潜在生物危害风险以及在由于病毒变异导致的疫苗无效等问题。针对这些弊端，新型疫苗应运而生。（2）多表位疫苗作为一种新型亚单位疫苗，具有安全无毒、稳定可控等优势。在治疗SARS、HIV、HBV等病毒研究方面更是首选。目前多表位疫苗在兽医实验室研究上方兴未艾，在临床应用方面还处于初级阶段，面临着一些亟待解决的问题：与蛋白抗原相比，串联线性表位肽免疫原性仍不够好，很难引起较强的免疫应答以获得长期的免疫力。临床免疫效果与传统疫苗仍有一定差距；表位疫苗研究多集中于线性表位，对构象表位的研究筛选准确性尚待提高；佐剂的使用一定程度上会增加表位疫苗的副作用；多肽合成以及纯化技术的局限性也增加了表位疫苗的使用风险；对于动物病毒而言，表位研究的不均衡也是在表位疫苗研究中存在的一个问题。如口蹄疫病毒主要集中于主要集中于B细胞表位和Th细胞表位的研究，对CTL细胞表位的研究仍处于空白。

针对上述问题，表位疫苗的研究要要进一步探索新的、更有效的研究方法。随着生物信息学的迅速发展，可以预见表位疫苗在今后的应用前景将越来越广阔。

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