吸烟对口腔癌前病变细胞中过氧化物还原酶1表达及丝裂原活化蛋白激酶信号通路的影响

张 弘, 张 英

(1. 中国医科大学附属口腔医院, 辽宁 沈阳, 110002; 2. 陕西省延安市人民医院, 陕西 延安, 716000)



吸烟对口腔癌前病变细胞中过氧化物还原酶1表达及丝裂原活化蛋白激酶信号通路的影响

张 弘1, 2, 张 英1

(1. 中国医科大学附属口腔医院, 辽宁 沈阳, 110002; 2. 陕西省延安市人民医院, 陕西 延安, 716000)

吸烟; 口腔癌前病变; 过氧化物还原酶1; 丝裂原活化蛋白激酶

口腔癌是发生在口腔的恶性肿瘤的总称，包括舌癌、口底癌、软硬腭癌、上颌窦癌等以及发生于颜面部皮肤黏膜的癌症，是头颈部较为常见的恶性肿瘤之一。口腔白斑是口腔癌最为常见的癌前病变，发病率约为10.47%, 单纯白斑的癌变率约为4%～17.5%, 白斑合并上皮异常增生者癌变率约为36%[1]。吸烟是口腔癌前病变发生的主要风险之一，但其在口腔癌前病变中的作用机制尚不明确。Prx1是过氧化还原酶家族中的主要成员之一，其表达增高提示肿瘤细胞凋亡受到抑制[2]。MAPK信号通路则在肿瘤细胞凋亡过程中发挥重要作用。本研究探讨吸烟对口腔癌前病变细胞株DOK中Prx1蛋白质与mRNA以及MAPK家族中3种激酶磷酸化表达的影响，分析吸烟对口腔癌前病变的作用机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

人口腔黏膜癌前病变细胞株DOK细胞购自上海富衡生物科技有限公司。Trizol试剂，Invitrogen。DMEM高糖液体培养基, HYCLONE。胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司。RTFQ-PCR试剂盒购自生兴生物技术(南京)有限公司。高产量cDNA逆转录试剂盒购自美国Applied Biosystems。RTFQ-PCR引物合成购自宁波康贝生化有限公司。一抗: p-JNK、p-ERK、p-p38, Cell Signaling Technology, Inc。Prx1购自Abcam公司。辣根过氧化物酶标记的二抗购自上海明睿生物技术有限公司。组织蛋白抽取试剂购自上海碧云天生物技术有限公司。BCA蛋白质定量试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。聚偏二氟乙烯膜购自深圳市凯宏膜环保科技有限公司。免疫印迹试验预染蛋白MAPKer购自杭州佐正生物科技有限公司。免疫印迹试验封闭液II购自上海博谷生物科技有限公司。香烟烟变应原试剂购自北京协和医院变态反应科。

1.2 细胞培养

DOK细胞株常规培养于含104U/L链霉素、104U/L青霉素、12%胎牛血清的DMEM高糖液体培养基中，将培养基置于5% CO2、37 ℃的孵箱内，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。观察组应用50 μL溶媒稀释的香烟烟抗原浸液处理口腔癌前病变细胞株DOK 14 d, 对照组单纯应用50 μL溶媒处理口腔癌前病变细胞株DOK 14 d。

1.3 观察指标

应用倒置显微镜观察2组DOK细胞形态变化。应用Trizol试剂分别提取观察组与对照组细胞总RNA, 分光光度计测量总RNA质量与浓度, cDNA逆转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA, RTFQ-PCR试剂盒定量扩增目的基因，应用相对定量方法进行结果分析，计算2-△△Ct。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为参照，基因引物序列如下: GAPDH-R, 5′-tgtagaccatgtagttgaggtca-3′; GAPDH-F, 5′-aggtcggtgtgaacggatttg-3′; Prx1-R, 5′-tccccatgtttgtcagtgaa-3′; Prx1-F, 5′-gggtattcttcggcagatca-3′。

Western Blot检测2组细胞中Prx1 蛋白的表达，以及MAPK家族p-JNK、p-ERK、p-p38表达情况。DOK细胞处理同RTFQ-PCR, 分别收集2组细胞，对组织样品进行蛋白提取并用BCA蛋白质定量试剂盒进行蛋白定量，电泳分离蛋白，每个样品上样30 μg, 湿法转移到聚偏二氟乙烯膜上，封闭，一抗孵育: p-JNK(1∶1 000)、p-ERK(1∶2 000)、p-p38(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)。洗膜，二抗孵育：羊抗小鼠-HRP(1∶5 000), 羊抗兔-HRP(1∶5 000)。电化学发光显色。应用Qantity one 4.62软件灰度扫描，分析结果。

2 结 果

2.1 形态学观察

倒置显微镜下观察未处理前的DOK细胞呈不规则多边形或梭形，观察组与对照组均未见明显变化。

2.2 Prx1 mRNA与蛋白的表达

观察组Prx1 mRNA表达为(1.92±0.39), Prx1 蛋白表达为(0.76±0.22); 对照组分别为(1.01±0.17)、(0.60±0.18), 2组差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 MAPK家族p-JNK、p-ERK、p-p38的表达

观察组p-JNK表达为(0.42±0.01), p-ERK表达为(0.46±0.02), p-p38表达为(0.27±0.06); 对照组分别为(0.59±0.03)、(0.27±0.01)、(0.36±0.05), 2组差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

口腔癌是世界第6大癌症，平均每年发病人数达到50万人，并且每年死亡人数高达25万人。目前公认吸烟是口腔癌发生发展的主要风险因素[3]，吸烟者较非吸烟者罹患口腔癌的风险高7～10倍。研究[4]表明，吸烟可产生大量的活性氧簇(ROS)，ROS可氧化脂质、多糖与蛋白质，包括DNA与RNA。对于ROS引起的氧负荷，机体的抗氧化系统主要有抗氧化酶，如过氧化物还原酶(Prxs)。Prxs广泛存在于真核及原核生物的细胞质、细胞核中，是特异性巯基类抗氧化酶，通过催化和还原脂质氢过氧化物，避免细胞受到进一步损伤，已知在哺乳动物中存在6种亚型，以Prx1在组织中含量最为广泛与丰富。研究[5]发现Prx1具有刺激细胞增殖、促进细胞凋亡、参与细胞信号转导及保护其他蛋白的氧化等作用。口腔癌前病变组织白斑中，随着异常增生程度的增加, Prx1表达增加，显著高于正常组织[6]。此外, Prx1在前列腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤中表达较高[7], 提示Prx1的高表达与恶性肿瘤的发生发展密切相关。本研究中，观察组Prx1 mRNA与蛋白均显著高于对照组，提示观察组细胞受损程度大于对照组。

MAPK信号通路在调控细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭与分化中发挥重要作用，主要包括JNK、ERK、p38三条信号通路。正常情况下, JNK、ERK、p38三条通路可促分化。在应激状态下, ERK抗细胞凋亡而JNK、p38则促进细胞凋亡[8]。本研究中，观察组p-JNK与p-p38显著低于对照组，而p-ERK显著高于对照组，提示观察组细胞的抗凋亡作用显著。有研究[9]显示，香烟中的主要成分尼古丁通过提高p-ERK的表达促进非小细胞肺癌A549细胞的增殖。

国外学者体内细胞实验[10]发现，在Prx1高表达的细胞中，细胞凋亡信号调节激酶1活性受抑，进而抑制MAPK信号转导通路下游的p38级联反应; 而Prx1低表达的细胞中, p38与JUN显著激活。在本次研究中，在香烟烟抗原浸液处理的观察组中, Prx1高表达而p-JNK与p-p38表达降低, p-ERK表达升高，提示长期吸烟刺激口腔黏膜病变，可能通过诱导过氧化物还原酶1表达增高，调控丝裂原活化蛋白激酶信号通路，活化JNK、ERK、p38磷酸化水平，继而发挥抗细胞凋亡的作用，促使口腔癌前病变发展为口腔癌。

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[5] 张福军, 张国栋, 杨凯, 等. 口腔鳞状细胞癌和颊黏膜癌前病变基因表达和细胞通路的差异性研究？[J]. 重庆医学, 2015, 44(23): 3180-3182, 3186.

[6] 刘圆月, 侯菊花. 口腔黏膜癌前病变细胞和患者血清中p53、p16及PCNA的表达及意义[J]. 中国老年学杂志, 2013, 33(4): 826-827.

[7] 蔡重阳, 汤志刚, 黄强, 等. Peroxiredoxin 1与EMT相关蛋白在胰腺癌组织中的表达及其临床意义[J]. 安徽医科大学学报, 2015, 61(3): 368-371, 372.

[8] 王琪, 汪洋, 李媛, 等. 丝状支原体丝状亚种的脂质相关蛋白通过MAPK信号通路诱导EBL细胞分泌IL-1β的研究[J]. 中国预防兽医学报, 2016, 38(2): 87-91.

[9] 刘慰华, 刘世明, 林双峰, 等. 黄连素通过S1P2-MAPK信号通路抗糖尿病肾纤维化作用机制研究[J]. 中国药理学通报, 2013, 29(5): 723-728.

[10] Hwang K E, Park D S, Kim Y S, et al. Prx1 modulates the chemosensitivity of lung cancer to docetaxel through suppression of FOXO1-induced apoptosis[J]. International journal of oncology, 2013, 43(1): 72-78.

2017-01-20

辽宁省卫计委青年项目(20144Y0199)

张英

R 739.8

A

1672-2353(2017)13-230-02

10.7619/jcmp.201713084