日常沙门菌血清分型思路于一次盲样考核中的应用

余慧宏，宋建新，黄洁琼

(景德镇市疾病预防控制中心，江西 景德镇 333000)

日常沙门菌血清分型思路于一次盲样考核中的应用

余慧宏，宋建新，黄洁琼

(景德镇市疾病预防控制中心，江西 景德镇 333000)

目的 通过梳理日常沙门菌血清分型思路及总结积累的经验，借以探讨考核样本中沙门菌血清分型方法。方法采用GB4789.4-2010沙门菌检验位相变异试验简易平板法，作为参考方法。同时运用传代与简易平板法相结合的方法，以及血平板-滤纸条搭桥法进行鉴定。结果 运用传代与简易平板法相结合的方法和血平板-滤纸条搭桥法，一次性诱导鉴定出准确的沙门菌血清型。简易平板法诱导三次得出菌型。结论 经过这次考核样的检测，提高了检验人员对沙门菌血清型的鉴定水平，提升了解决位相变异试验所遇难题的能力。

盲样考核；沙门菌；血清学分型；质量控制

室间质量评价是由专门机构采用一系列办法，比较和评价地区间、省内或全国范围内各实验室的检验质量。近十年来，本实验室陆续参加了不同范围内的室间质量评价考核。对于考核盲样中分离出，仅出现一相鞭毛抗原的沙门菌，应用简易平板法[1-3]，均可一次成功诱导出另一相鞭毛抗原，继而将简易平板法，应用于日常工作分离的沙门菌血清型鉴定中。在实践中发现，有的沙门菌须诱导三次，甚至三次以上才可成功，这样不仅费力，而且费时。有此经验后，为了能在考核规定时间内得出沙门菌血清型，在运用简易平板法作为参考方法的同时，还引用了其他方法进行诱导，并顺利完成沙门菌菌型鉴定，现将情况报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源2016年细菌实验室能力评价考核中，江西省疾病预防控制中心下发的，需进行病原菌检测的一份盲样。按照考核样品作业指导书要求，对肠道、呼吸道病原菌分离培养及鉴定，须鉴定到种或型。通过分离培养，得到一株肠道致病菌，经鉴定为沙门菌（8：r：-）。 查阅抗原表后知，需进行位相变异试验诱导出另一相鞭毛抗原，才能判定血清型。

1.2 主要试剂和仪器血平板购自郑州安图生物工程股份有限公司；三糖铁琼脂、营养琼脂、半固体琼脂均由青岛海博试剂有限公司生产；沙门菌属诊断血清（60种）由宁波天润生物药业有限公司提供；小刀、眼科小镊子、普通滤纸剪成10mm×15mm的长方形滤纸条均由本实验室高压灭菌。

1.3 方法

1.3.1 采用GB4789.4-2010沙门菌检验位相变异试验简易平板法。将半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清（Hr）1环，加在半固体平板表面，放置温箱片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位点种待检菌株，因诱导平板琼脂含量少，加之新鲜配制的缘故，放入培养箱时，不可倒置培养。36℃培养24～48h，取形成蔓延生长的菌苔边缘菌检查。当凝集效价低或菌量难以达到血清学试验要求时，出现不容易判读的情况，则把远端菌接种营养琼脂，培养后鉴定。未出现第二相鞭毛抗原，则如前所述程序再诱导一次，直至出现第二相鞭毛抗原。

1.3.2 传代与简易平板法相结合的做法将沙门菌于三糖铁琼脂上传代，36℃培养18～24h后，刮取菌苔进行血清学试验，未出现另一相鞭毛抗原，再传代培养后，仍未出现第二相鞭毛抗原，则挑取菌苔按简易平板法进行诱导。

1.3.3 依照文献介绍的血平板-滤纸条搭桥法进行[4，5]。在血平板上，用小刀划出两条距离7～8mm的平行线，平行线均贯穿血平板，将两平行线间的琼脂掏出，手拿镊子将滤纸条长边横跨沟槽，紧贴于两边琼脂上。滤纸中央滴加已知相鞭毛抗原的诊断血清（Hr）约 50μl，刮取菌苔接种于沟槽一端的滤纸边缘（作为原点），平板放入36℃恒温箱，倒置培养18～24h，取原点彼岸菌苔进行血清凝集试验。

2 结果

简易平板法诱导三次得出菌型，沙门菌传代与简易平板法相结合的做法和血平板搭桥法，一次性诱导成功，较简易平板法提前2～3d，鉴定出准确的沙门菌血清型，为黄金海岸沙门菌（8：r：l，w）。

3 讨论

盲样考核是对检测人员技能、实验室内质量控制情况的一种检验[6-8]，要求我们注重平时的实验室质量控制工作，如仪器的维护和检定校准、培养基和诊断血清的质量控制等。诊断血清对病原菌鉴定非常关键，血清实则是蛋白质，需要避开引起蛋白质变性的不利因素，夏天长时间使用时，最好放置在经过冷藏的冰袋上，严格无菌操作，防止污染，任何混浊与颜色改变，应视为杂菌污染，不应使用。

本次盲样考核样品中分离出肠道病原菌沙门菌。沙门菌分类原则是以O抗原来分群，每群再以H抗原来分型[9]，大多数沙门菌是有动力的，而且多数为双相菌，具有2个位相的沙门菌可出现位相变异，在一定条件下自发地出现相互转变，加已知相的抗血清培养出另一位相的方法，简称为诱导，通过诱导可以确定沙门菌的血清型。近年来，本实验室将简易平板诱导法应用到，从业人员肠道沙门菌检测工作中。在实际工作中体会到，有些沙门菌经多次诱导才能得出血清型，为了提高简易平板法一次诱导成功率，总结出以下几点注意事项：自肠道体检标本中分离出的菌株，应立即进行诱导试验，不能及时诱导的菌株，应暂放温箱保存，不可放入冰箱，低温易导致沙门菌鞭毛丢失；诱导平板应新鲜配制，这样的诱导平板水分含量充足，有利于沙门菌鞭毛运动；诊断血清滴加量，不宜过多，否则沙门菌受抑制，不易生长。经过实践后，一次诱导成功率得到了提高。由于简易平板法类似于血清学单向免疫扩散法，血清和菌量的比例难以把握，因此有的菌株还是得几次诱导才能确定血清型。

摸索影响因素过程中，查阅相关文献。据文献报道，无论是小倒管法、小玻管法，还是简易平板法位相变异试验，都存在几次诱导才能最终鉴定出沙门菌血清型的情况，并推荐了其他实践方法，如血平板-滤纸条搭桥诱导法、M肉汤培养法等[10-13]。由于盲样考核均是有时间限定的，提示着应运用快捷、简便的诱导方法得出准确结果。便采用简易平板法，作为参考方法，同时运用传代与简易平板法相结合的方法，以及血平板-滤纸条搭桥法进行沙门菌血清型鉴定。血平板-滤纸条搭桥法是切实可行的方法，首次运用，便取得成功，给予启示，应善于发现工作难点，积极努力寻求解决方法作为动力，更新知识储备，拓宽工作思路，了解工作创新及前沿技术，可有效地促进提高实验室日常检测水平，也有利于盲样考核检测工作的顺利完成。

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R446.5，R378.2+2

A

1674-1129(2017)05-0690-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.017

2017-01-17；

2017-08-07)