肝、肾机械灌注保存技术进展

史源，沈中阳 （天津市第一中心医院器官移植中心，天津市器官移植临床医学研究中心，卫生部危重病急救医学重点实验室，天津 300192）

器官移植是目前治疗终末期器官衰竭最为有效的手段［1］。作为器官移植发展里程碑的静态冷保存（static cold storage， SCS）技术的迅速发展，极大地推动了器官移植事业的进步。SCS技术仍是现在器官保护最常用的技术，为全球多数器官移植中心广泛使用。UW液和HTK液是目前国际上应用最广泛的冷保存液。由于目前供体器官短缺形势严峻，以及国内供体器官捐献数量迅速增加，出现越来越多的边缘供体。导致术后早期移植物功能不良（delayed graft function，DGF）、原发性无功（primary nonfunction， PNF）及胆道并发症明显增多［2-6］。SCS技术已经无法满足临床需要，理想的器官保存方式应该包括功能评估及修复，以期提高器官利用率。

目前，器官捐献供体评估主要依靠：供体年龄、体重、肝脏酶学指标、胆红素水平、肝脏影像学检查、血清钠、血清肌酐（serum creatinine，Scr）、重症监护病房（intensive care unit，ICU） 停留时间、冷热缺血时间及病理学检查如脂肪变性等参数综合评价。热缺血时间是衡量热缺血损伤最直接的标志。热缺血时间延长会继发术后移植物失功和肝移植后胆道狭窄等并发症，故器官获取时须尽量减少热缺血时间。目前，热缺血时间普遍定义为从功能性热缺血收缩压持续（至少2分钟）＜50 mmHg（1mmHg＝0.133 kPa）或血红蛋白氧饱和度低于70%开始直至冷保存液开始灌洗。各个器官对热缺血时间耐受程度略有不同，一般认为供肝＜30分钟，供肾＜60分钟。

机械灌注（machine perfusion， MP）技术最早由Lindbergh及Carrel于20世纪30年代提出［7-8］。30年后在Belzer与Starzl的推动下，临床上出现了利用血浆及含红细胞循环液的低温机械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）技术［9-14］。近年来，由于器官短缺形势严峻及边缘供体增加，MP技术再次成为研究热点，不同于SCS，MP技术通过连续动态灌注输送养分供给，在实时动态评估器官活力的同时，同步实现器官保存与修复。该项技术对延长器官的保存时限，改善器官质量具有重要价值，有助于提高器官利用率。但MP受压力、灌流速度、氧合情况等参数综合影响，其广泛应用还需大样本量、多中心的临床验证。

1 不同类型的机械灌注保存技术

在MP保存期间，机械泵将循环液（无细胞类型含血液成分）及营养底物经器官脉管系统持续泵入，可以经历氧合或无氧合，接近生理状态。温度控制装置则维持局部温度，根据灌注过程中维持温度不同，可以分为HMP、亚低温机械灌注（midthermic machine perfusion， MTMP）、亚常温机械灌注（subnormothermic machine perfusion，SNMP）和常温机械灌注（normothermic machine perfusion， NMP），其各自维持的温度为4～10℃、10～20℃、20～25℃、35～38℃。根据是否携氧可分为携氧灌注系统与非携氧灌注系统。目前，低温非携氧机械灌注有LifePort肝脏修复系统 （Organ Recovery Systems， Zaventem， 比 利时），常温携氧机械灌注有Organ Ox（Organ Ox Ltd，Oxford，英国）系统及多功能机械灌注Liver Assist系统（Organ Assist BV，Gronigen，荷兰），多处于前临床阶段，国内相关设备尚处于研发阶段。

HMP可以降低器官代谢速率，降低缺血损害。主要利用无细胞成分的循环液，主要使用UW-MP或者KPS机械型保存液。其核心技术在于压力控制，而非流量控制，因为低温环境下，微循环毛细血管床收缩，较高压力波动直接损害器官［15-17］。因此，肾脏低温灌注压力维持在25 ～ 30mmHg为佳［18-19］。肝脏也是如此，低温灌注时，门静脉压力维持在3 ～ 5mmHg为宜［20-21］。虽然苏黎世大学提出单独门静脉灌注技术，但是尚存争议，肝动脉及门静脉双重灌注有助于降低术后胆道并发症［22］。因为仅肝动脉供应胆道周围血管丛，因此应该进行双重灌注。

与HMP相比，NMP最接近生理状态的局部环境，可以实时动态判断器官活力，而且具有损伤修复功能。一般肾动脉灌注压力为70～85mmHg［23-24］，肝动脉灌注压力60～105 mmHg［25-26］。较之流量控制，压力控制技术可以更好地保护肾小球功能及结构。SNMP灌注技术不仅可以避免低温损害，而且代谢速率较NMP缓慢，含红细胞及无细胞循环液均适用。肾动脉灌注温度为40 mmHg［27］，肝动脉25 ～ 70 mmHg，门静脉 4 ～ 8 mmHg［28］。而控制性氧合复温是指将低温获取的器官由低温环境缓慢向20℃过渡，避免突然地温度改变，避免“热休克”，减少线粒体损伤［29］，改善组织能量供应。

2 肝脏常温机械灌注保存技术

目前供肝短缺问题日益加剧，但是由于边缘供体增加，实际利用率较低，许多供肝遭遇废弃。2014-2015年，英国1 282例供体中，仅924例（占72%）适合移植，而仅812例（占63%）最后接受了移植。美国同期仅78%（6 312/8 144）的供肝接受了移植，而同期有3 200例患者死亡或错过移植机会［30-32］。传统单纯低温保存技术已经无法满足保存边缘供肝的实际需求。

2.1 NMP技术保存的临床研究:英国伊丽莎白女王医院尝试将废弃肝脏经NMP装置修复评估后重新移植。该研究首次报道经过NMP装置修复并评估的临床废弃肝脏，重新接受移植。评估方案包括灌注液分析、胆汁生成、血流及大致外观。在此之前，供肝均经历不同时间的低温保存。4个心脏死亡器官捐献（donation after cardiac death，DCD）供肝因热缺血时间过长而被弃用，1个脑死亡器官捐献（donation after brain death，DBD）供肝因肝功能异常而被弃用。平均保存时间为798分钟（725～951分钟）。移植过程均平稳。受者平均住院时间为10天（6～14天）。至今为止，在平均7个月（6～19个月）的随访时间内，受者肝功能均处于正常水平。由此可见，边缘供体接受常温机械灌注装置的活力评估，可将供肝原发性无功的风险降至最低，有效提高利用率［33］。牛津大学开展了NMP保存供肝的临床一期实验，利用NMP运输保存供肝后接受移植。在临床一期实验中，供肝获取均为标准流程，获取后连接到NMP装置，运输至受体所在医院。实验组为NMP保存运输的供肝，对照组为低温保存的，1：2配比。结果有20例患者接受NMP运输保存后的供肝，NMP平均保存时间9.3小时（3.5～18.5小时），对照组低温保存平均时间8.9小时（4.2～11.4小时）。肝移植术后两组移植肝30天生存率近似（100%比97.5%，P＝1.00）。术后7天内天冬氨酸转氨酶 （aspartate transaminase， AST）平均峰值NMP组明显低于对照组，417 U（84～4 681 U）比902 U（218～8 786 U），P＝0.03。这是世界上首次报道NMP运输保存后的供肝接受肝移植，验证其安全性及可行性。NMP对于提高供体肝脏利用率，改进移植肝功能具有一定意义［34］。

使用NMP保存废弃人体肝脏，最长保存时间可达24小时。牛津大学报道使用NMP技术成功保存废弃人体供肝24小时。共有13例废弃人体供肝纳入实验。灌注装置自动控制，循环液含红细胞，经过氧合。灌注装置的温度、压力、流量及氧气流量均可自动调整。所有供肝均灌注保存24小时，监测分析肝功能及供肝病理。供肝根据供体病史、获取情况及肉眼情况进行预期活力分层。结果证实，24小时的NMP保存具有可行性，废弃肝脏可依据代谢及合成功能进行活力评估，经过NMP灌注保存后，具有重新移植的可行性。因此，NMP灌注保存时限可达24小时。潜在益处不仅限于活力评估 （可付诸临床实践），还可延长边缘供肝保存时间，缺血及其他损伤的恢复（为NMP期间治疗提供可能）［35］。

2.2 NMP技术对于供肝减体积过程中保护作用的实验研究：天津市第一中心医院报道了NMP技术在供肝减体积移植（reduced-size liver transplantation，RSLT）过程中的保护作用。选用24只健康的体重为25 ～ 35 kg的巴马小型猪作为研究对象，随机分为两组：A组（NMP组）供肝未经历热缺血，快速连接至NMP系统，在此环境中进行减体积手术操作；B组（UW液低温保存组）供肝同样未经历热缺血，获取后单纯低温保存在UW液中，进行减体积手术操作。减体积后供肝进行无静脉转流条件下的肝移植手术，记录一般情况，减体积手术数据，观察术后肝功能，移植肝病理等。结果表明，两组术中出血量存在显著性差异（P＜0.05），术后3天及5天，A组血清丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、AST及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平显著低于B组（P＜0.05），术后2天及5天，A组血清乳酸水平明显低于B组（P＜0.05）。移植肝病理提示，A组肝细胞坏死明显减轻，肝窦及内皮细胞完整性优于B组。因此，NMP对于减体积手术操作过程中的供肝具有一定保护作用［36］。

2.3 对胆道损伤的保护作用:对于DCD供体而言，胆道并发症风险较高，常温机械灌注技术与低温保存相比，可以减少胆道损伤，格罗宁根大学Sanna教授等分别使用NMP及低温保存，保存大鼠DCD供肝及非DCD供肝3小时，结果证实，DCD供肝开放后NMP组胆道损伤标志物γ-谷氨酰转移酶及乳酸脱氢酶水平明显低于低温保存组，NMP组胆汁碳酸氢盐水平（反映胆道上皮功能）是低温组的2倍。投射电镜及扫描电镜结果均提示NMP组胆道上皮受损明显减轻，因此，与低温保存相比，NMP为胆道提供形态及功能的双重保护作用［37］。

Liu等［38］使用NMP技术保存热缺血60分钟的DCD猪肝，10小时的保存过程中NMP组灌注参数稳定，再开放后，NMP组较UW液保存组胆汁量明显增加，转氨酶水平较低，病理提示肝实质及胆道上皮损伤明显减轻，Ki67免疫组化染色提示肝外胆道上皮再生明显，这些均提示NMP保存对DCD供肝具有一定胆道保护作用。

2.4 对脂肪肝修复作用：Okamura等［39］使用SNP装置对50%以上的大鼠脂肪供肝进行灌注保存4小时，并与HTK液单纯低温保存进行对比，结果模拟开放后，SNP组不仅丙氨酸氨基转移酶水平明显降低，而且谷氨酸脱氢酶亦明显降低。而且门静脉压力、肝组织三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量、胆汁量、高迁移率族蛋白B1（high mobility group box， HMGB-1）水平等指标均明显优于其他组。电镜检查提示，窦状隙微循环及肝细胞线粒体损伤均明显减轻。这些均反映了MP保存技术对于脂肪供肝的保护作用。Jamieson等［40］亦报道了机械灌注保存技术对于猪脂肪肝保护作用，在60小时保存过程中，脂肪变性程度减少，肝脏质量改善。

2.5 供体器官严重感染的治疗：多伦多大学利用肺常温机械灌注装置（ex vivo lung perfusion，EVLP）治疗因感染遭废弃的肺脏，实验组使用大剂量抗菌药物（400 mg环丙沙星或500 mg阿奇霉素，15 mg/kg万古霉素，2 g美罗培南） 保存治疗12小时，对照组未给与抗菌药物保存12小时。结果实验组支气管肺泡灌洗菌落计数明显减少，内毒素水平明显下降，移植后受体氧合明显改善，肺血管阻力明显降低。那么肝脏NMP技术是否可参考借鉴呢［41］？

3 肾脏常温机械灌注保存技术

肾脏HMP主要包括：Life port肾脏修复系统、脉冲式灌注泵系统（RM3，WatersMedical Systems，Minneapolis， MN，美国）和 Kidney Assist 设备（Organ Assist BV Gronigen，荷兰）。自HMP问世以来，肾脏保存方式的选择一直是争论焦点。理论上，HMP具有保持血管通畅、提供部分能量和氧气、清除代谢废物等优势。低温无氧机械灌注，在较低的25 ～ 30 mmHg灌注压力下，已经被证实可减少DGF发生率，提高移植物生存率［42］。根据一项大规模随机对照临床试验证实，与低温静态保存相比，LifePort可以降低术后DGF发生率，提高移植物存活率，特别对于边缘供肾［43-44］。该装置利用滚轴泵，产生持续脉冲式灌注压力。大量基础与临床研究结果显示，无氧HMP可显著降低肾移植术后DGF的发生，减少受者住院费用并减轻医疗痛苦与负担，然而DGF的发生与受者长期生存时间无直接相关。尽管阻力指数、灌注液损伤标志物是术后DGF的危险因子，但是无法预测术后生存率，无法准确提供是否废弃的依据［45-46］。

肾脏HMP液主要为KPS-1（kidney preservation solution，UW-G）液和HTK液。KPS-1液为国际公认的规范且标准的肾脏机械灌注液，在国内也得到广泛使用。灌注压、流量、阻力指数和温度是肾脏低温机械灌注系统主要参数，可作为评价供肾质量的部分依据。LifePort温机械灌注中，高阻力指数为肾脏质量低的独立危险因素，单肾灌注压为30～50 mmHg的情况下，灌注流量应至少大于40 ml/min；高灌注压较低灌注压有可能对肾脏产生灌注损伤。有研究结果表明，肾脏平均流量大于156 ml/min，阻力系数小于 0.27 mmHg/（ml.min）时（按100 g肾脏质量计算）可能提示移植肾术后无DGF的发生。但是，不能单纯依据这些参数决定供肾的使用或废弃，应结合临床综合考虑［47］。尽管HMP修复移植肾脏机制尚未完全明晰，但诸多研究结果证实，在灌注充分的情况下（流量、阻力指数符合标准，灌注参数稳定），尽量减少冷缺血时间及灌注压力对移植肾术后功能恢复有积极作用。

剑桥大学将临床废弃供肾，经过体外常温机械灌注（ex vivo normothermic perfusion，EVNP）修复评估后成功接受移植。供者为35岁男性，因心脏死亡后，获取供肾明显灌注不均，微血栓形成面积较大，反复冲洗无明显改善，因此双肾均遭弃用。供肾经过60分钟 EVNP修复，使用氧合的红细胞为主的循环液，在35.2℃条件下。EVNP过程中，供肾灌注不均之处均消失。100 g左肾平均血流量及尿量为68.0 ml/min及560 ml，右肾为59.9 ml/min及430 ml。基于EVNP灌注参数，双肾均适合移植。在肾移植后，两个供肾均未出现相关并发症，移植肾功能良好，术后3个月左肾血肌酐水平106.08μmol/L，右肾143.21μmol/L。因此，EVNP技术可用于评估、挽救修复临床废弃肾脏［18］。

综上所述，肝、肾机械灌注保存技术通过提供氧气、血液供应及能量供应，不仅可以在保存器官的同时进行实时动态的活力监测，更重要的是可以进行受损器官的进行修复，但是具体修复机制尚未明确，可以通过添加特定药物（例如抗感染治疗、溶栓治疗等）、基因修饰或者干细胞治疗提高修复效果，提高器官利用率及安全性。此外，器官机械灌注装置还应考虑便携性、通用型及稳定性，以及中国器官捐献的具体情况。

纵观机械灌注保存机器或技术，可分为6个评估层次：保存、运输、活力评估、修复、基因或干细胞等治疗、多器官通用便携，目前世界上尚未出现同时满足这些要求的机器，我们需更加努力研究国产的保存机器，提高保存质量，提高器官移植患者的安全性及预后，推动中国器官移植的持续发展。