Tip30基因过表达对人胃癌细胞生长的影响及分子机制

程智勇 杨雁鸿 杨丽莉 李高岩 门晓彦

Tip30基因过表达对人胃癌细胞生长的影响及分子机制

程智勇1杨雁鸿2杨丽莉3李高岩1门晓彦4★

目的探讨Tip30基因过表达对人胃癌AGS细胞增殖、凋亡的影响及相关分子机制。方法人胃癌AGS细胞中Tip30基因过表达采用腺病毒转染法，使用实时定量PCR和Western blotting验证Tip30过表达的效果，分别采用MTT法、划痕试验检测细胞增殖、迁移情况，流式细胞术分析细胞凋亡，Western blotting分析p53、Bax、Bcl⁃2蛋白表达。结果过表达组AGS细胞Tip30基因mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组（P＜0.05）。与对照组比较，Tip30过表达后，细胞增殖、体外迁移能力均显著减弱（P＜0.05）；Tip30过表达后AGS细胞凋亡率相比对照组显著增大，Tip30过表达促进AGS细胞凋亡与上调p53、Bax蛋白表达，下调Bcl⁃2蛋白表达水平相关。结论Tip30基因过表达可抑制人胃癌AGS细胞增殖活性、体外迁移能力，且促进胃癌细胞凋亡。

人胃癌细胞；Tip30基因；细胞增殖；凋亡；迁移

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

人胃癌细胞株AGS购自中国科学院上海细胞库；反转录试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、预染蛋白标准购自美国Thermo Fisher Scientific；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，real⁃time PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；新生胎牛血清、RPMI⁃1640培养基购自美国Gibico公司；MTT、DMSO、EDTA购自美国Sigma公司；Tip30基因过表达腺病毒购自汉恒生物科技（上海）公司；鼠抗人Tip30抗体为美国Imgenex公司；p53、Bax、Bcl⁃2抗体购自美国Abcam公司；PBS溶液、胰蛋白酶、细胞裂解液、青霉素、链霉素购自江苏凯基生物技术公司；GAPDH抗体、羊抗鼠或羊抗兔二抗购自北京博奥森生物技术公司；Annexin V⁃FITC、碘化丙啶（PI）购自美国BD公司；引物合成委托Invitrogen公司。流式细胞仪（BD，US），荧光显微镜（Olympus，日本），凝胶成像分析系统、Real⁃time PCR检测仪（Bio⁃Rad，US），酶标仪（Bio⁃Tek，美国）。

1.2 细胞培养

AGS细胞复苏后，采用含10%胎牛血清的RP⁃MI⁃1640培养基，在37℃、20%CO2细胞培养箱中恒温培养，每天观察细胞生长状态并及时更换新鲜培养液，当细胞生长密度达到80%左右时，用胰蛋白酶消化后传代，分成3～4个细胞培养瓶继续培养，取生长状态良好的对数生长期细胞用于后续转染及分析检测实验。

1.3 细胞转染

过表达组为转染Tip30过表达腺病毒的AGS细胞，对照组为AGS细胞，不做其它处理。取对数生长期人胃癌AGS细胞于转染前12 h种植6孔板，当细胞汇合度达到40%左右时，更换不含胎牛血清的RPMI⁃1640培养基饥饿培养3 h，之后按照感染复数MOI等于100的浓度添加Tip30过表达腺病毒，转染时长为4 h，转染完成后更换含10%胎牛血清的新鲜培养基，继续培养至后续各项指标检测所需的时长。

1.4 Real⁃time PCR检测mRNA水平

2.2.1 患者感染和微生物学检查情况 在136例用药患者中，12例肺部感染，3例高热，2例真菌感染，2例腹腔感染，6例皮肤真菌感染，5例足趾真菌感染，5例灰指甲。103例送微生物学检查，送检率为 75.74%，其中 35 例（1，3）-β-葡聚糖实验（G 实验）阳性，1例可疑阳性；7例白色念珠菌阳性，1例光滑念珠菌阳性，3例真菌阳性 （无具体菌属），56例G试验阴性、作预防感染用药。

Tip30过表达腺病毒转染后48 h收集两组细胞，每孔添加适量Trizol和氯仿，移液器吹打裂解细胞，提取总RNA，去基因组后检测RNA纯度，纯度合格且无蛋白质污染，进行逆转录。据Tip30基因片段设计引物，上游引物为5′⁃GTCTTTATTTT⁃GGGCGCCAG⁃3′，下游引物为5′⁃CCCAGC TTTCCCTCTGGTGG⁃3′。内参β⁃actin上游引物为5′⁃GCCTCCGGCAGGACCACCGG⁃3′，下游引物为5′⁃CGGTGAGATCGCGGCCCGCC⁃3′。按照逆转录试剂盒说明书具体步骤进行逆转录操作。逆转录成cDNA后，进行定量分析，以每个样本中的β⁃actin作为内参，反应条件为95℃预变性2 min，然后94℃变性30 s，目的基因Tip30 60℃退火30 s，内参β⁃actin 55℃退火30 s，72℃延伸1 min，总共40个循环。PCR产物进行琼脂糖浓度为1.5%的凝胶电泳，凝胶成像系统中使用紫外灯观察DNA条带，拍照并保存。每个样品实验重复3次，基因相对表达量计算分析使用2⁃△△Ct方法。

1.5 MTT法检测细胞增殖

MTT法检测细胞增殖使用96孔板，分别在过表达腺病毒转染后继续培养12、24、36、48、60、72 h，每个时间点均设置4个复孔，培养结束后每孔添加20 μL MTT溶液继续培养4 h，用移液器移弃MTT，加DMSO后用酶标仪测定波长在490 nm处的吸光度值（OD490nm），未接种细胞的孔加入RPMI⁃1640培养基作为调零孔。细胞相对生长率等于每组细胞各个时间点的吸光值与第12 h吸光值的比值。

1.6 流式细胞术分析细胞凋亡

细胞转染后48 h收集包括上清及贴壁的全部细胞，PBS悬浮漂洗2次，每个样品加入5 μL Annexin V⁃FITC按照试剂盒说明书操作进行染色，避光反应0.5 h，加入10 μL PI后1 h内完成流式细胞仪上机检测。

1.7 Western blotting分析蛋白表达

Tip30基因过表达腺病毒转染后48 h收集每组AGS细胞，加细胞裂解液裂解完全，收集上清，测定样品蛋白浓度，加上样缓冲液后高温变性，样品行SDS⁃PAGE电泳后电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉常温封闭2 h后孵育一抗，4℃摇床孵育过夜，其中Tip30、Bax、Bcl⁃2抗体稀释比例为1∶1 000，GAPDH稀释比例为1∶2 000，一抗孵育完成后进行二抗常温孵育2 h，二抗稀释比例为1∶4 000；二抗孵育完成后暗房显影、定影，胶片扫描后蛋白条带用Image J软件进行灰度检测与半定量分析。

1.8 划痕试验考察癌细胞迁移能力

人胃癌细胞AGS过表达腺病毒转染后12 h，移弃RPMI⁃1640培养基，用无菌移液器枪头在细胞培养6孔板底部划出1条痕迹，用PBS清洗2次，去除漂浮细胞后添加含10%血清的RPMI⁃1640培养基，在CO2细胞孵育箱中继续培养24 h，显微镜下计数同一视野中裂痕上的细胞个数，每个视野计数3次，求平均值。

1.9 统计分析

统计分析采用SPSS 20.0软件，数据以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，检验水准为0.05。

2 结果

2.1 Tip30过表达效果

与对照组比较，过表达组AGS细胞转染后48 h，Tip30 mRNA水平显著升高（P＜0.05）（图1），过表达组Tip30蛋白表达也相应明显增多，见图2。

2.2 Tip30基因表达对细胞增殖的影响

结果如图3所示，与对照组比较，过表达组AGS细胞转染60 h、72 h后，细胞数目显著减少（P＜0.05），其它时间点两组间细胞数量比较差异不具有统计学意义。

图1 RT⁃PCR分析AGS细胞中Tip30 mRNA的表达水平Figure 1 The analysis of Tip30 mRNA expression level in AGS cells by RT⁃PCR

图2 Western blotting检测AGS细胞中Tip30蛋白表达Figure 2 The protein expression level of Tip30 in AGS cells was examined by western blotting

2.3 Tip30基因表达对胃癌细胞AGS凋亡的作用及相关分子机制

过表达组AGS细胞转染后48 h细胞凋亡率为（14.28±3.16）%，明显大于对照组细胞凋亡率（2.04±0.37）%，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05），见图4。

Western blotting检测凋亡相关蛋白结果显示，与对照组比较，过表达组AGS细胞中促进细胞凋亡分子p53、Bax蛋白表达水平显著上升（P＜0.05），抗凋亡分子Bcl⁃2蛋白表达水平则明显下降（P＜0.05），见图5。

图3 Tip30过表达对AGS细胞生长的影响Figure 3 The influence of Tip30 overexpression on cell growth of AGS

图4 Tip30基因过表达对胃癌AGS细胞凋亡率的影响Figure 4 The effects of Tip30 gene overexpression on cell apoptosis rate in gastric cancer AGS cells

2.4 Tip30基因表达对胃癌细胞AGS迁移性能的影响

过表达组在24 h裂痕上迁移的细胞数目为（91±13）个，对照组迁移的细胞数目为（178±29）个，两组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05），说明过表达组细胞迁移能力弱于对照组。

3 讨论

肿瘤抑制基因Tip30与多种肿瘤的发生及转移具有一定的关系，如肝癌、食管鳞状上皮癌、肺癌及喉鳞状细胞癌瘤等［2⁃3，7］。Tip30在胰腺导管腺癌组织中表达缺失率为49.1%，正常组织中的缺失率为0%［4］。血清Tip30水平可作为卵巢癌、胆囊癌预后和诊断的分子标记［8⁃9］。Tip30低水平表达与胰腺癌患者不良预后关系密切［5］。Tip30基因缺失可通过激活胞质和胞核内EGFR信号通路促进动物体内肺腺癌的生长［10］。此外，Tip30还与化疗药物敏感性增强有关［11］，如二甲双胍通过上调肝癌细胞Tip30基因表达抑制索拉非尼的促肝癌细胞转移的作用［12］。

本研究结果显示，人胃癌细胞AGS中Tip30基因过表达可显著抑制细胞增殖，转染后60 h细胞数目明显减少，Tip30基因过表达促进胃癌细胞凋亡，还使体外迁移的细胞数目明显减少，抑制肿瘤细胞的迁移能力。多项研究报道Tip30基因表达与肿瘤细胞增殖、转移等关系密切。Tip30基因过表达可抑制胶质瘤细胞的生长和体外侵袭能力［13］。microRNA⁃10b通过抑制非小细胞肺癌和胰腺癌细胞Tip30基因表达增强肿瘤细胞的增殖和侵袭性能［14⁃15］。TGF⁃β1可通过沉默食管癌细胞Tip30基因表达促进肿瘤细胞的转移［16］。过表达Tip30基因的HepG2肝癌细胞明显降低了基质金属蛋白酶⁃2/ 9mRNA表达和蛋白的翻译，肝癌细胞的增殖、锚定非依赖性生长及肝癌细胞迁移能力均明显受到抑制［17］。抑制胰腺癌细胞系Capan⁃2细胞内源性Tip30表达可增强肿瘤细胞增殖克隆形成和成瘤能力，使另一胰腺癌细胞系PANC⁃1细胞中Tip30过表达，则抑制肿瘤细胞增殖克隆形成和成瘤能力［4］。上述结果为本研究结论提供一定支持。

Tip30基因表达可促进肿瘤细胞凋亡、延迟肿瘤细胞周期进展及抑制细胞转移能力［18］。研究表明，Tip30可通过诱导抑癌基因p53、促凋亡因子Bax表达，抑制Bcl⁃x1表达促进肿瘤细胞的凋亡［19］。若Tip30发生基因缺失或突变，将下调p53基因的表达，抑癌效应减弱，肿瘤细胞增殖活性相应增强，生长速度加快［18］。本研究结果表明，Tip30过表达抑制胃癌细胞生长，促进其凋亡，与上调p53、Bax表达，下调Bcl⁃2蛋白表达相关，与以上文献报道结果一致。腺病毒载体表达Tip30基因可通过p53基因依赖性或非依赖性途径抑制胃癌细胞株和骨肉瘤细胞株的增殖生长，是一种潜在的肿瘤生物治疗手段［20］。综上所述，人胃癌细胞AGS中Tip30基因过表达可显著抑制肿瘤细胞的增殖活性及体外迁移能力，并促进凋亡，作用机制与上调p53基因表达有关。

图5 Tip30基因过表达对胃癌AGS细胞中相关凋亡蛋白表达的作用Figure 5 The effects of Tip30 gene overexpression on relevant apoptotic protein expression levels in gastric cancer AGS cells

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The effect and molecular mechanism of Tip30 gene overexpression on cell growth in human gastric cancer cells

CHENG Zhiyong1,YANG Yanhong2,YANG Lili3,LI Gaoyan1,MEN Xiaoyan4★
(1.The first department of general surgery,the first hospital of Qinhuangdao city,Qinhuangdao,Hebei,China, 066000;2.The second department of tumor,the first hospital of Qinhuangdao city,Qinhuangdao,Hebei,China, 066000;3.Information section,the first hospital of Qinhuangdao city,Qinhuangdao,Hebei,China,066000; 4.The endocrinology department,Haigang hospital of Qinhuangdao city,Qinhuangdao,Qinhuangdao,Hebei, China 066000)

ObjectiveTo investigate the effect and underlying molecular mechanism of Tip30 gene overexpression on cell proliferation and apoptosis in human gastric cancer AGS cells.MethodsAdenovirus transfection was used to overexpress the Tip30 gene in human gastric cancer AGS cells.Tip30 overexpression was verified by real⁃time PCR and western blot.Cell proliferation was analyzed with the MTT method,a wound scratch assay was used to monitor cell migration activity,and the cell apoptosis rate was detected with flow cytometry.The expression level of p53,Bax and Bcl⁃2 was detected with western blot.ResultsThe mRNA and protein levels of Tip30 in human gastric cancer AGS cells were significantly higher in the overexpression group compared with the control group(P＜0.05).The proliferation and migratory ability of AGS cells in vitro were decreased when Tip30 was overexpressed(P＜0.05).The cell apoptosis rate was significantly increased in Tip30 overexpressing cells,and a corresponding up⁃regulation of p53 and Bax anddown⁃regulation of Bcl⁃2 was also observed.ConclusionOverexpression of Tip30 in human gastric cancer AGS cells inhibits both cell proliferation and migration in vitro,and enhances the AGS cell apoptosis.

Human gastric cancer;Tip30 gene;Cell proliferation;Apoptosis;Migration

秦皇岛市科学技术研究与发展计划项目(2012023A130)

1.河北省秦皇岛市第一医院普外一科，河北，秦皇岛066000 2.河北省秦皇岛市第一医院肿瘤二科，河北，秦皇岛066000 3.河北省秦皇岛市第一医院信息科，河北，秦皇岛066000 4.秦皇岛市海港医院内分泌科，河北，秦皇岛066000

★通讯作者：门晓彦，E⁃mail:mfcx55@163.com