左乙拉西坦对难治性癫痫大鼠海马组织中Slit2表达的影响①

聂 磊，毕艳旭，苗小风，王 影，王海燕

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

左乙拉西坦对难治性癫痫大鼠海马组织中Slit2表达的影响①

聂 磊，毕艳旭，苗小风，王 影，王海燕

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：观察左乙拉西坦对难治性癫痫大鼠海马组织中Slit2表达的影响。方法：Wistar大鼠随机分为对照组，模型组(IE组)，治疗组(LEV治疗组)，LEV对照组(LEV组)。腹腔注射氯化锂-匹罗卡品建立难治性癫痫大鼠模型，造模成功后LEV组和LEV治疗组给予LEV200mg/(kg·d)灌胃，对照组和IE组给予等量生理盐水，应用免疫组化法在第1周、2周和4周检测各组海马组织中Slit2的表达量。结果：LEV组和对照组比较，Slit2的表达量差异无统计学意义(P>0.05)；IE组Slit2表达量明显降低，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；LEV治疗组与IE组比较，Slit2表达量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：Slit2的表达变化促进海马发生苔藓纤维化(MFS)参与难治性癫痫形成，LEV控制癫痫发生，可能与上调Slit2的表达有关。

难治性癫痫；左乙拉西坦；Slit2；大鼠

癫痫是由大脑神经元反复发作的异常放电引起的、以中枢神经系统功能失常为特征的慢性脑部疾病，约20%～30%患儿发作不能得到有效控制，称为难治性癫痫(refractoryepilepsy,RE)。儿童RE诊断标准为：对于已正确诊断的癫痫患儿，应用正规抗癫痫药物(2种以上)合理治疗6个月到1年后，发作仍未能减少50%者为儿童RE[1]。在RE的发病机制中，神经网络结构重组是其病理特征，海马苔藓纤维发芽(mossyfibersprouting，MFS)被认为是其发生、发展以及耐药的关键之一，其促使大脑形成异常兴奋性网络结构。神经轴突导向因子Slits家族之一Slit2目前研究最为广泛，主要在神经元中表达，而在癫痫患者中，其在星形胶质细胞和神经元中均表达，研究证实其与MFS的发生密切相关[2]。RE的治疗仍然以口服药物为主，左乙拉西坦(levetiracetam,LEV)作为抗癫痫新药，已经获得了临床的认可，取得了较好的临床疗效，尤其在RE的治疗中起了巨大的作用[3,4]，但其具体的抗癫痫机制是尚不清楚。本实验通过建立氯化锂-匹罗卡品(lithium-pilocarpine，Li-pilo)点燃的RE大鼠模型，观察LEV在不同时间点对Slit2表达的影响，探讨LEV可能的抗癫痫机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性Wistar大鼠(哈尔滨医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK2013001)110只，清洁级，体重约180～220g，称体重编号后随机分成对照组24只、模型组(IE组)31只、治疗组(LEV治疗组)31只和LEV对照组(LEV组)24只。

1.2 动物造模

IE组和LEV治疗组先给与氯化锂(天津基准化学试剂有限公司)135mg/kg腹腔注射，24h后给与阿托品1mg/kg腹腔注射，20min后再腹腔注射匹罗卡品(美国Sigma公司)50mg/kg,然后观察大鼠的行为。按照Racine癫痫行为分级[5]：0级:无反应或抽搐停止；I级:嘴和面部出现节律性抽动；Ⅱ级:嘴和面部出现节律性抽动,同时出现点头；Ⅲ级:在Ⅱ级基础上出现前肢抽动；Ⅳ级:出现后肢站立；Ⅴ级:全面性强直阵挛发作伴不自主跌倒。达到Ⅳ级及以上即视为造模成功，若发作程度达不到等级，于30min后再次给予未达等级大鼠注射匹罗卡品20mg/kg,直至达到发作等级。

1.3 灌胃给药

将LEV片剂(UCBPharmaS.A.比利时)碾碎并溶解于生理盐水中，给与LEV治疗组和LEV组LEV(200mg/kg·d)灌胃，同时给予对照组和IE组等量的生理盐水。

1.4 标本处理

于造模成功后各时间点，每组随机抽取8只大鼠，10%水合氯醛麻醉，先后用生理盐水100～200mL和4%的多聚甲醛200mL经左心室灌注，待大鼠肝脏变白及四肢抽动后断头取脑，将脑组织放入4%的多聚甲醛溶液中固定。

1.5 免疫组织化学方法

把经过固定和包埋的固态大鼠脑组织置于石蜡切片机上，切成约厚度为4μm的切片进行免疫组化染色，在显微镜镜下(×100)观察每张切片海马区域阳性细胞数，随机选取5个视野计算Slit2的阳性

细胞数，算得平均值后记录。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 动物模型制作结果

腹腔注射Li-pilo约20～40min后，大鼠开始出现癫痫发作，持续抽搐30min以上腹腔注射10%水合氯醛5mL/kg止痉，降低死亡率，实验中5只大鼠死亡，2只未出现抽搐，3只未达发作等级，均予以剔除。

2.2 海马组织Slit2表达量

Slit2阳性细胞数：LEV组和对照组比较，Slit2的表达量差异无统计学意义(P>0.05)；IE组Slit2表达量明显降低，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；LEV治疗组与IE组比较，Slit2表达量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 大鼠海马区Slit2阳性细胞数(个/高倍视野

注：a与对照组相比:P>0.05；b与对照组相比：P<0.05；c与对照组相比：P<0.05；d与IE组相比，P<0.05。

3 讨论

癫痫是儿童时期常见的神经系统疾病之一，儿童是一个不断发育和成熟的过程，RE对其身心健康造成严重影响，若发展为难治性癫痫持续状态(refractorystatusepilepticus,RSE)，其死亡率达16%～39%[6]，无论对患儿本人、家庭还是社会都会造成严重的后果。Slits家族在神经轴突导向、神经细胞迁移、神经细胞形态分化等多种生命活动有重要的调节作用，其功能主要通过LRR-2(leucine-richrepeat2)结构域与Robos结构域结合实现。在双侧对称的生物，中线是发育中神经系统的重要中介部位，是动物传递左右两侧信息以及协调运动和整合感觉输入的基础，大多数的轴突投射到对侧前要越过中线，然而这些轴突并不是毫无秩序、混乱或者反复穿越中线，中线穿越的过程离不开Slits的精细调控[7]。Slit基因敲除后，许多轴突连接不能离开中线，甚至有些轴突连接反复跨越中线[2]。在对小鼠视网膜轴突发育的研究实验、鸡和小鼠胚胎脑干纵向轴突发育实验以及人类胚胎干细胞多巴胺能神经轴突培养的体外实验均证实Slits对神经元轴突有排斥作用，Slits作为排斥性因子，保证了神经元轴突只跨越中线一次，准确无误到达既定位置，阻止轴突反复跨越中线形成异常的网格结构。Fang[2]等实验发现，在RE动物模型中1天～2周，Slit2的表达持续减低，认为这不是癫痫发生的原因，而是对神经元痫性放电的一种适应性变化，同时也提示下调Slit2后可能会促进MFS，干扰神经的正常连接，在RE的发病机制中有所参与。

LEV作为新型抗癫痫药，具有大脑保护作用[8]，同时又其他抗癫痫药物不具有的优点，比如；生物利用度高、线性药动力学曲线、血浆蛋白结合率低、无肝酶诱导作用等，总之具有较高的安全性。大量的国内外临床研究证实，左乙拉西坦在难治性癫痫的治疗中效果显著[9，10]，而关于其具体的抗癫痫机制尚不十分清楚。本实验的研究中，我们发现LEV治疗组与模型组相比，Slit2的表达升高，结合Slit2与MFS密切相关的功能，因此，推测LEV可能通过增加Slit2的表达，阻止甚至逆转大脑海马组织发生苔藓纤维化，一定程度上减轻异常神经网络结构的形成，降低癫痫发作的敏感性，控制难治性癫痫的发作。

[1]顾硕，王治平，鲍南,等.多学科协作模式诊断和治疗儿童药物难治性癫痫研究[J].中国实用儿科杂志，2014，29(12)：909-912

[2]FangM,LiuGW,PanYM,etal.AbnormalexpressionandspatiotemporalchangeofSlit2inneuronsandastrocytesintemporallobeepilepticfoci:Astudyofepilepticpatientsandexperimentalanimals[J].BrainRes，2010, 1324:14-23

[3]LeeYJ，KangHC，KimHD，etal.Efficacyandsafetyofadjunctivelevetiracetamtherapyinpediatricintractableepilepsy[J].PediatrNeurol，2010，42(2):86-92

[4]SheinbergR,HeymanE,DaganZ.CorrelationBetweenEfficacyofLevetiracetamandSerumLevelsAmongChildrenWithRefractoryEpilepsy[J].PediatrNeurol,2015,52(6)：624-628

[5]RacineRJ.Modificationofseizureactivitybyelectricalstimulation.Motorseizure[J].EletroencephalogrClinⅡNeurophysiol,1972,32(3):281-294

[6]SinghalA,TripathiM.Refractorystatusepilepticus[J].NeurologyAsia, 2013, 18: 67-71

[7]于奇，周启升，赵晓,等.神经轴突导向分子Slit的功能及其分子作用机制研究进展[J].生理学报，2012，64(2):220-230

[8]裴艳莹，邹艳红，王海燕,等.左乙拉西坦对癫痫大鼠海马组织中CAMKⅡ及NCX3 表达的影响[J].黑龙江医药科学，2015，38(4)：26-28

[9]GrossoS,FranzoniE,CoppolaG,etal.Efficacyandsafetyoflevetiracetam:anadd-ontrialinchildrenwithrefractoryepilepsy[J].Seizure,2005,14(14):248-253

[10]舒志刚,卫国. 左乙拉西坦治疗低龄难治性癫痫患儿临床研究[J]. 中国实用神经疾病杂志,2014,17(2)：4-6

The effect of levetiracetam on the expression of Slit2 in hippocampus of rats with refractory epilepsy

NIELei,BIYan-xu,MIAOXiao-feng,WANGYing,WANGHai-yan

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China)

Objective: To observe the effect of levetiracetam (LEV) on Slit2 in hippocampus of rats with fractory epilepsy. Methods: Wistar rats were randomly divided into control group, model group (IE group), treatment group (LEV treatment group), and LEV control group (LEV group). Refractory epilepsy rat modes were induced by intraperitoneal injection of lithium-pilocarpine; LEV group and LEV treatment group were given levetiracetam(200mg/kg per a day) by filling the stomach after the mode was established successfully; the control group and IE group were given the same dose of saline solution. The expression of Slit2 in rat hippocampal's tissues were detected respectively at the 1st week, 2nd week and 4th week by immunohistochemical method. Results: There was no significant difference between LEV group and control group(P>0.05).Comparedwiththecontrolgroup,theexpressionofSlit2ofIEgroupdecreasedsignificantly(P<0.05).ComparedwithIEgroup,theexpressionofSlit2ofLEVtreatmentgroupincreasedsignificantly(P<0.05). Conclusion: The expression of Slit2 promotes rat hippocampal mossy fiber sprouting(MFS) involving in the formation of refractory epilepsy. Levetiracetam is correlated with raising expression of Slit2 and reducing MFS when it controls the incidence of seizures during curing the refractory epilepsy.

refractory epilepsy; levetiracetam; Slit2; rat

佳木斯大学科学技术研究项目，编号：13Z1201542。

聂磊(1977～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，主治医师。

王海燕(1957～)女,黑龙江佳木斯人,硕士，主任医师,教授，硕士研究生导师。E-mail：yhw1957@126.com。

R

B

1008-0104(2017)01-0050-03

2015-11-10)