3株杀鲑气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

王家祯 ， 耿昕颖 ， 董文龙 ， 单晓枫 ， 高云航

(吉林农业大学动物科学技术学院， 吉林长春130118)

3株杀鲑气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

王家祯 ， 耿昕颖 ， 董文龙 ， 单晓枫 ， 高云航

(吉林农业大学动物科学技术学院， 吉林长春130118)

为研究草鱼、鲢鱼感染细菌性疾病及临床合理用药提供理论依据，从草鱼、鲢鱼脾脏分离3株优势菌分别进行人工感染、生化鉴定、16S rRNA基因序列分析及药敏试验。结果表明，3株优势菌均为革兰染色阴性杆菌，人工感染试验证实均为致病菌。11种药物敏感试验表明，3株分离菌均对氟苯尼考敏感，而对红霉素、阿奇霉素、强力霉素、磺胺间甲氧嘧啶、环丙沙星耐药。该结果可为研究鱼类杀鲑气单胞菌的鉴定及预防鱼类细菌性疾病提供依据。

杀鲑气单胞菌 ； 16S rRNA ； MIC药敏试验

杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)是气单胞菌属气单胞菌科的革兰阴性短杆菌，广泛分布于世界各地，主要引起鲑鱼科鱼类的“疖疮病”、“败血症”[1]、造成鱼体严重溃烂，但随着人们不断深化研究发现杀鲑气单胞菌也可侵染其他鱼类，并且可与其他气单胞菌属混合感染，对水产养殖业造成严重的经济损失。近年来，由于水体恶化，密集饲养等问题导致鲢鱼在养殖过程中遭受危害。本试验从病鱼体内分离纯化3株优势菌并对其进行了理化特性和分子生物学特性及耐药性分析。以期为治疗淡水鱼的细菌性疾病提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源 病死鱼采自长春某水产市场。死亡草鱼体质量50 g左右，鲢鱼体质量100 g左右。鲢鱼症状表现为体表鳞片大量脱落，头部眼底和尾部有出血点，草鱼腹部有腹水，剖检均发现脾脏发黑、肠道有出血点。

1.2 主要试剂 TSA琼脂，购自北京陆桥生物技术有限责任公司；细菌微量生化反应管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司，11种抗生素均购自北京海洋医药化工生物科技有限公司。

1.3 细菌的分离 取发病症状明显的草鱼和鲢鱼，在无菌条件下采集脾脏，划线接种于TSA琼脂培养基上，28 ℃培养24 h，肉眼观察菌落形态、大小、颜色等。进行革兰染色，观察细菌形态特征，得到3株优势菌分别命名为LBY1507、LHY1507 、CQY1412。

1.4 人工感染试验 将健康草鱼(50±5 g)10条/组，一组为对照组，注射无菌生理盐水，0.2 mL/条；其余组均为感染组，分别注射CQY1412、LBY1507、LHY1507三株优势菌的2×105、2×106、2×107、2×108CFU/mL细菌悬液，0.2 mL/条。以上各组均于23 ℃独立隔离饲养7 d，观察草鱼发病情况。计算CQY1412、LBY1507、LHY1507半数致死量(LD50)，将各组发病明显的草鱼在无菌条件下分离再培养，并比较分离菌株和攻毒菌株的理化特征。

1.5 生理生化鉴定 将菌株CQY1412、LBY1507、LHY1507分别在无菌条件下穿刺接种于细菌生化鉴定管中，对其进行动力性等检测，参照微量生化反应说明书及伯杰氏细菌鉴定手册[2]方法鉴定纯化菌。1.6 16S rRNA基因PCR扩增 分别在无菌条件下将菌株CQY1412、LBY1507、LHY1507接种于TSB液体培养基中，180 r/min 28 ℃震摇24 h，提取细菌总DNA，作为PCR反应模板进行扩增，转至E.coliDH5-α感受态细胞，挑取阳性克隆质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.7 系统进化树分析 3株分离菌株的测序结果在GenBank数据库中BLAST软件进行比对，应用MAGA6.0软件建立系统发育进化树。

1.8 药敏试验 将菌液密度分别稀释至106CFU/mL，11种抗生素采用肉汤微量稀释法对分离菌株的最小抑菌浓度[3]进行测定。每株分离菌进行3次重复试验。

2 结果

2.1 菌株形态 分离纯化后的3株菌,菌落表面湿润微凸，边缘光滑呈黄白色圆形，革兰染色为阴性，短杆状两侧钝圆。

2.2 人工感染试验结果 结果如表1所示，3株分离菌均对健康草鱼有不同程度的致病性，菌株CQY1412、LBY1507、LHY1507的半数致死量LD50为：1.07×107、5.31×106、1.06×106CFU/mL。人工感染的发病草鱼均表现症状为腹部、眼底有出血点，肛门红肿。与自然感染发病鱼一致，由此可证明3株分离菌均存在致病性。

2.3 生理生化试验结果 3株菌为无动力细菌，硫化氢、苹果酸、柠檬酸、己二酸、苯乙酸、甘油试验均为阴性，甲基红、吲哚、氧化酶、甘露糖、半乳糖试验为阳性。CQY1412菌株不能使蔗糖、乳糖发酵，尿素及V-P试验为阳性，而LBY1507 、LHY1507菌株使葡萄糖只产酸不产气，可初步确定为杀鲑气单胞菌。

表1 分离株对草鱼人工感染试验结果

2.4 16S rRNA基因扩增结果 如图1所示，PCR扩增CQY1412、LBY1507、LHY1507 3株菌的16S rRNA基因片段约为1 510 bp经人工校对得到序列为1 450 bp，采用BLAST软件进行同源性比对，3株分离菌与杀鲑气单胞菌核苷酸同源性在98%～99%之间。

图1 16S rRNA PCR 扩增结果

M：DL-2 000 Marker; 1:CQY141206 16S rRNA PCR 产物； 2：LBY150705 16S rRNA PCR 产物； 3：LHY150701 16S rRNA PCR 产物

2.5 系统进化分析 如图2所示，从NCBI核酸数据库中选取不同亚种杀鲑气单胞菌16S rRNA基因序列进行系统发育分析，利用MEGA6.0软件构建进化树。LBY150705、LHY150701分别与杀鲑气单胞菌无色亚种菌株登录号AY910844.1、KC244777.1在同一分支，而CQY141206则与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种菌株登录号AB680803.1聚在同一分支上。这3株菌与气单胞菌属其他种间亲缘关系较远，综合常规生理生化和16S rRNA基因序列分析结果表明，菌株LBY150705、LHY150701为杀鲑气单胞菌无色亚种，而CQY141206为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种。

2.6 药敏试验结果 如表2所示，CQY141206只对阿米卡星和氟苯尼考较为敏感。LBY150705对恩诺沙星、阿米卡星、氯霉素、氟苯尼考、庆大霉素较为敏感。LHY150701则只对氯霉素、氟苯尼考、庆大霉素敏感。

表2 分离菌药敏试验结果

3 讨论

杀鲑气单胞菌主要存在于海水、淡水中，是鱼类疖病的主要诱因，在传统观念里杀鲑气单胞菌主要感染鲑科鱼，但目前人们发现，也可感染非鱼类。本试验中草鱼及鲢鱼都存在体表侧鳞片脱落，眼底出血点，严重者出现溃疡灶。从草鱼和鲢鱼体内分离出的3株优势菌进行人工感染试验，3株菌都具有较强的致病性，且人工感染症状与自然感染症状一致。菌株LHY1507、 LBY1507的理化性质相同与杀鲑气单胞菌的无色亚种相同，而菌株CQY1412则与杀鲑亚种相同。为更加准确的鉴别菌株CQY1412、LHY1507、 LBY1507的亚种，将3株菌的16S rRNA基因序列与GenBank登录的杀鲑气单胞菌无色亚种和杀鲑气单胞菌比对，其一致性均达到98%以上，将不同种属气单胞菌与3株优势菌构建系统进化树发现LHY1507、 LBY1507与不同的无色亚种在一分支上，而CQY1412与杀鲑亚种在一分支上，结合理化试验结果，进一步说明菌株LHY1507、 LBY1507为杀鲑气单胞菌无色亚种，CQY1412株为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种。国外报道中多数气单胞菌属对氨苄青霉素、万古霉素、青霉素、克林霉素等均有不同程度耐药[4-5],对氟喹诺酮类药物高度敏感。同时对于鲑鳟鱼类感染杀鲑气单胞菌的防治，已经开发出相关的灭活疫苗[6]。而我国目前仍以投放抗生素为主要的治疗手段。本试验进行的药敏试验表明，3株菌对氟苯尼考均高度敏感，除CQY1412株只对于阿米卡星较敏感外，但是对于其他药物均有不同程度耐药这与美洲红点鲑源[7]的杀鲑亚种菌株耐药谱不尽相同，推测与环境和抗生素使用有关。菌株LHY1507、 LBY1507对氯霉素和庆大霉素都高度敏感，LBY1507株对阿米卡星和恩诺沙星较敏感，而LHY1507对庆大霉素较敏感，此结果可以为白鲢、草鱼养殖过程中患出血症提供早期的预防依据。但国内已报到的大西洋鲑鱼无色亚种菌BH1352[8]对庆大霉素耐药，而对强力霉素较为敏感，这与LBY1507、 LHY1507菌株的药物敏感情况略有差异。本试验为进一步研究杀鲑气单胞菌的致病性及耐药性提供理论依据，同时也对于杀鲑气单胞菌的防治应更科学用药，避免盲目用药导致病原菌的耐药性，逐步减少抗生素药物的使用。

[1] Austin B，Austin D A.Bacterial fish pathogens :disease of farmed and wild fish[M].Springer，1999：111-177.

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[3] CLSI.Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals; Approved Standard-Fourth Edition.CLSI document VET01-A4[J].Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute;2013.

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[7] 吕俊超，张晓华，王燕,等.养殖大菱鲆病原菌杀鲑气单胞菌无色亚种的分离鉴定和组织病理学研究[J].中国海洋大学学报,2009,39(1):91-95.[8] 李绍戊,王荻,连浩淼,等.大西洋鲑杀鲑气单胞菌无色亚种的分离鉴定和致病性研究[J].水生生物学报,2015,(01):234-240.

Isolated,Identification and antibiotic resistance analysis of threeAeromonassalmonicida

WANG Jia-zhen , GENG Xin-ying ，DONG Wen-long ，SHAN Xiao-feng , GAO Yun-hang

(College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118,China)

The research was aimed to study the reasonable drug application for the infected bacterial diseases ofCtenopharyngodonidellaandSilvercarps, in the clinic.The pathogens were isolated from spleens of diseasedsilvercarpsandC.idellus.They were donfinned to be the pathogens of the disease by artificial infection experiments,biochemical identification,16 srRNA gene sequence analysis and drug sensitivity test.The results showed that the isolated strains were pathogenic Gram-negative bacterium.The 11 durgs sensitive test indicated that all isolates were sensitive toFlorfenicol, resistant toErythrocin，Azithromycin，Doxycycline,Sulfamerazine,andCiprofloxacin.It will offer references for rapid identification ofAeromonassalmonicidaand treatment of the fish disease.

Aeromonassalmonicida;16S rRNA;MIC drug susceptibility test

GAO Yun-hang

；2015-11-16

吉林省重点科技攻关项目(20150204065NY)

王家祯(1991- )，女，硕士生，研究方向为动物疫病防治，E-mail：496006960@qq.com

高云航 E-mail：gaoyunhang@163.com

S941.4

A

0529-6005(2017)02-0078-03