敲低RACK1基因抑制C2C12细胞中MyoG和MHC基因表达

张 晶，王胜军，刘 妍，汪文俊，刘玉兰

（1．武汉轻工大学，动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023；2．中南民族大学，生命科学学院，湖北武汉 430074）

敲低RACK1基因抑制C2C12细胞中MyoG和MHC基因表达

张 晶1*，王胜军1,2，刘 妍1,2，汪文俊2，刘玉兰

（1．武汉轻工大学，动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023；2．中南民族大学，生命科学学院，湖北武汉 430074）

本实验旨在研究RNA干扰（RNAi）RACK1基因对C2C12成肌细胞中肌分化标志基因MHC和MyoG表达的影响。将人工合成的靶向RAKC1基因的3条siRNA（1，2，3）转染C2C12细胞，用RT-qPCR方法检测并筛选干扰效率最高的1条siRNA。将筛选出的siRNA转染C2C12成肌细胞并诱导细胞分化，通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光方法在mRNA及蛋白水平检测RACK1基因沉默后对MHC和MyoG表达的影响。此外，Western blot方法检测RACK1基因沉默后对PI3K/Akt和Erk/MAPK通路激活的影响。结果表明：RACK1-siRNA-2干扰效率最高，转染48 h后抑制率可达70%。随后，C2C12细胞转染siRNA-2，诱导分化48h后RT-qPCR表明，MHC和MyoG的mRNA表达均显著性下调（P＜0．05）；诱导分化72 h后，Western blot和免疫荧光结果表明MHC和MyoG的蛋白表达明显低于对照组,但AKT和Erk磷酸化水平未见明显变化。上述结果表明，干扰RACK1能显著抑制MHC和MyoG的表达，提示RACK1正向调控C2C12成肌细胞的分化。

成肌细胞；激活性蛋白激酶C受体l；肌细胞生成素；肌球蛋白重链；RNA干扰

RACK1（激活性蛋白激酶C受体l）是含7个色氨酸-天冬氨酸（WD40）重复序列结构的蛋白。它由GNB2Ll基因编码，与G蛋白β亚基显著同源，并在所有真核细胞生物中高度保守[1]。RACK1是一种多功能支架蛋白，介导多条胞内信号转导，调控细胞增殖、凋亡、迁移、转录和蛋白合成等过程[1-3]。RACK1基因敲除小鼠的原肠胚无法正常形成，揭示其在胚胎发育中发挥重要作用[4]。Tang等[5]研究发现，RACK1在通城猪和长白猪胚胎期65 d骨骼肌中显著差异表达，提示其在骨骼肌发育中发挥作用，但具体功能和调控机制仍然未知。

骨骼肌分化是一个复杂的过程，包括成肌细胞增殖、退出细胞周期、迁移、融合以及最后多核肌管的形成[6]。在肌分化的过程中，一系列骨骼肌特异性基因开始表达，肌细胞生成素（myogenin，MyoG）和肌球蛋白重链（Myosin heavy chain，MHC）是其中比较关键的基因。MyoG是骨骼肌分化的决定因子，调控成肌细胞融合和肌纤维形成[7-9]MyoG敲除小鼠因无肌肉形成，在出生前后致死[10]MHC是构成骨骼肌纤维内粗肌丝的主要成分。肌纤维类型主要由肌纤维内表达的MHC类型来决定[11]。

本研究将C2C12成肌细胞作为研究模型，将细胞内源性RACK1用RNAi进行敲低表达，研究RACK1对C2C12细胞分化基因MHC和MyoG表达的影响，从而揭示RACK1基因表达变化对胚胎骨骼肌生长发育的影响。

1 材料与方法

1．1 主要试剂 C2C12细胞（小鼠成肌细胞）由华中农业大学赵书红教授惠赠；胎牛血清、马血清、DMEM高糖培养基、胰酶、TRIzol试剂、liPofecta mine 2 000 Transfection Reagent均购自Invitrogen公司；3条RACK1siRNA由Invitrogen公司设计合成；PrimeScript RT reagent Kit WithgDNA Eraser反转录试盒和SYBR Premix Ex TaqTMRT-PCR试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；全蛋白提取试剂盒KGP2100购自南京凯基生物发展有限公司；MyoG抗体、Akt抗体、P-Akt抗体、Erk1/2抗体、P-Erk1/2抗体、β-action抗体、HRP-goat Anti-Mouse IgG均购自Cellsignaling公司；MF-20（MHC抗体）购自DHSB公司。

1．2 主要仪器设备 RT-PCR仪（7500 Real-time PCRsystem，ABI公司）；NanodroP2 000超微量分光光度计（Thermo）；电泳仪、电泳槽及转膜仪（Bio-Rad）；荧光显微镜（Nikon）。

1．3 C2C12成肌细胞培养及诱导分化 C2C12 成肌细胞株常规复苏后，用DMEM高糖培养基（含10%的胎牛血清，1%谷氨酰胺，1%双抗），在体积分数5% CO2，37℃的培养箱中培养。当细胞增殖融合至 70% ～ 80% 时，更换为含2%马血清的DMEM分化培养基进行诱导分化。

1．4 RACK1siRNA转染C12C12细胞 3条RACK 1siRNA序列见表1。用liPofectamine 2 000转染试剂将RACK1siRNA及阴性对照siRNA转染细胞。转染前24 h，将细胞接种到培养板或培养皿中，当细胞达到大概80%左右时进行转染。根据lipofecta mine 2 000的操作说明进行转染，转染5 h后更换新鲜培养基。其中siRNA用量为50 nmoL/L。

1．5 基因mRNA表达测定 细胞总RNA提取、cDNA 合成、Real-time PCR均参照刘妍等[12]的方法。Real-time PCR引物见表2。基因mRNA相对表达量计算采用Livak等[13]的2-ΔΔCt法，以β-actin为内参基因。采用SPSS17．0统计软件进行t检验，以P＜0．05表示差异显著性标准，P＜0．01表示差异极显著性标准。

1．6 Western blot 本实验参照刘妍等[12]的方法。用凯基全蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，测定浓度后，进行SDS-PAGE电泳。电泳后，采用BIORAD转膜仪将样品转移至PVDF膜，将膜置于封闭液（5%脱脂乳的PBST）室温封闭3 h，加一抗4℃冰箱过夜。洗膜后将膜孵育在含二抗的PBST溶液中，室温下孵育3 h，用ECl试剂进行荧光显色，于AlPha Innotech成像系统中检测及分析条带强度。

1．7 免疫荧光 4%多聚甲醛固定细胞爬片20 min，DPBS洗3次，每次10 min；用0．2% Triton×-100透化10 min，DPBS洗3次；5% BSA室温封闭30 min，DPBS洗3次；加一抗（用1%BSA按1∶40稀释）放在湿盒里，4℃孵育过夜；弃去一抗，DPBS洗3次，加入FITC标记二抗（用1%BSA按1∶100稀释），湿盒内37℃避光孵育2 h，DPBS洗3次；DAPI避光孵育10 min，荧光显微镜下观察结果。

2 结 果

2．1 RACK1siRNA干扰效率检测及筛选 为了研究RACK1对C2C12细胞分化的影响，设计靶向RACK1基因的3条siRNA序列并转染细胞，实现细胞内源性RACK1的低表达。用脂质体分别将3条RACK1siRNA和Cy3标记的阴性对照转染C2C12细胞，转染5 h后，通过观察阴性对照的红色荧光强度，以确定siRNA的转染效率。转染48 h后，通过RT-qPCR检测RACK1mRNA的表达，筛选出干扰效率最高的1条siRNA。由图1A结果显示，转染5 h后C2C12细胞中出现的红色荧光较强，且转染效率达80%以上。RT-qPCR结果显示，3条siRNA均能显著地抑制细胞内RACK1基因的表达（P＜0．05，图1B），其中siRNA-2的干扰效率最高（抑制率约70%），因此选择RACK1siRNA-2进行后续的干扰实验。

表1 3条RACK1siRNAs序列

表2 Real-time PCR引物序列

图2 干扰RACK1对MyoG、MHC基因mRNA表达的影响

2．2 干扰RACK1对MyoG和MHC基因mRNA表达的影响 分别将RACK1siRNA-2和阴性对照转染C2C12细胞，转染12 h后，将细胞的生长培养基换成分化培养基。在诱导分化48 h后，采用RT-qPCR检测RACK1、MHC、MyoG的基因转录情况。结果显示，与对照组相比，RACK1siRNA-2组细胞内源性RACK1mRNA的表达显著受到抑制（P＜0．01，图2）,其抑制率约为70%。此外，在对RACK1基因进行干扰后，分化标志基因MHC和MyoG的mRNA表达均显著性下调（P＜0．05，图2）。

2．3 干扰RACK1对MyoG和MHC基因蛋白表达的影响 别将RACK1siRNA-2和阴性对照转染C2C12细胞，转染12 h后，将细胞的生长培养基换成分化培养基。在诱导分化72 h后，采用western blot和免疫荧光检测MHC和MyoG的蛋白表达情况。Western blot结果显示，与对照组相比，RACK1siRNA-2组的MHC和MyoG的蛋白明显下调（图 3A）。免疫荧光结果显示，与对照组相比，RACK1siRNA-2组的MHC阳性细胞明显减少，而MyoG阳性细胞的数目虽无明显增多，但部分细胞的绿色荧光强度明显减弱。这些结果表明，干扰RACK1能有效抑制C2C12分化过程中MHC和MyoG的表达。

2．4 干扰RACK1对Akt和Erk磷酸化水平的影响分别将RACK1siRNA-2和阴性对照转染C2C12细胞，转染12 h后，将细胞的生长培养基换成分化培养基。在诱导分化72 h后，采用western blot检测Akt和Erk磷酸化水平。Western blot结果显示，与对照组相比，RACK1siRNA-2组的Akt和Erk磷酸化水平均无明显差异（图4）。

图 3 干扰RACK1对MHC和MyoG蛋白表达的影响

图 4 干扰RACK1对Akt和Erk磷酸化水平的影响

3 讨 论

哺乳动物骨骼肌生长发育是一个复杂的过程，主要包括骨骼肌成肌细胞增殖、分化和多核肌管的形成。而这一过程是在生肌调节因子（MRFs）的精密调节下有序地进行。MRFs包括Myf5、MyoD、myogenin、Myf6，且这4个成员都具有一个相似的结构特征,即碱性螺旋-环-螺旋 （basic helixloop-helix, bHLH） 结构域。其中MyoG在分化早期被激活，其表达象征成肌细胞的开始。成肌细胞分化后相互融合为多核肌管，最后形成肌纤维。成熟肌纤维主要有肌球蛋白重链（MHC）组成，并且MHC决定肌纤维的类型。在骨骼肌生长发育的过程中，多种肌生成相关基因都发挥着各自的功能，构成一个复杂而精确的正负调控网络。目前已发现大量重要基因参与成肌分化过程，但成肌分化的调控机理尚未完成阐明。

RACK1在组织中广泛表达，但在不同组织和细胞中，由于结合不同信号蛋白，则发挥不同的生物功能。主要参与调控胚胎发育、细胞生长、细胞分化、增殖、凋亡、迁移等多种生物活动等[14-16]。现已发现RACK1所结合的重要信号蛋白与结构蛋白已达到数10种，如PKC、Src、integrinβ、PDE4D5、FAK、STATs、P85、IGF-I等[1-3]。Tang等[5]研究发现，通城猪和长白猪骨骼肌发育的重要时间点为胚胎期65 d，而在此关键时间点RACK1在通城猪中的表达量急剧下调。这暗示RACK1在骨骼肌发育中发挥作用，但具体功能和调控机制仍然未知。

本文研究结果显示，3条siRNA均能显著地抑制细胞内RACK1基因的表达，其中siRNA-2的干扰效率最高。通过基因干扰敲低C2C12细胞中RACK1表达后，成肌标志基因MyoG和MHC的表达在mRNA和蛋白水平均明显受到抑制，表明下调RACK1表达阻止C2C12成肌细胞分化，提示RACK1可能参与正向调控骨骼肌分化过程。

癌症相关研究发现RACK1能结合IGF-1R，影响IGFs下游PI3K/Akt、Erk/MAPK通路的激活调控细胞增殖和凋亡[17-18]。PI3K/Akt途径调控肌肉特异性基因的表达，诱导和维持肌细胞分化[19-20]。Erk1/2 MAPK信号通路促进肌细胞的增殖并抑制分化[21-22]。本研究表明，RACK1干扰组与对照组相比，成肌细胞分化后Akt和Erk1/2的磷酸化水平未见明显差异，推测RACK1可能不是通过影响PI3K/Akt和Erk/MAPK通路激活调控C2C12细胞分化。

4 结 论

综上所述，本研究通过基因干扰敲低C2C12成肌细胞内源性RACK1的表达，从而探究其对C2C12细胞分化的影响。研究结果表明，下调RACK1的表达能显著抑制成肌标志基因MyoG和MHC的表达，表明RACK1可能促进骨骼肌分化过程，但其调控机制可能与PI3K/Akt和Erk/MAPK通路无关。

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Knock-down ofRACK1Ιnhibits the Expressions of Myog and MHC Genes in C2C12 Myoblast

ZHANG Jing1*,WANG Sheng-jun1,2,Liu Yan1,2, WANG Weng-jun2, LⅠU Yu-lan1
(1. Hubei Key laboratory of Animal Nutrition and Feedscience, Wuhan Polytechnic University, Hubei Wuhan 430023, China; 2. College of lifesciences,South-Central University for Nationalities, Hubei Wuhan 430074, China)

The purpose of the study was to investigate the inf l uence of RACK1genesilencing by RNA interference (RNAi) on the expressions of two myogenic dif f erentiation markgenes (MHC and MyoG) in C2C12 myoblast. We transfected three chemically synthesized RACK1siRNA (siRNA-1,2,3) into C2C12 myoblasts, and detected the interference efficiency with RT-qPCR in order toselect thesiRNA with the highest interference efficiency. Then, we transfected the selected siRNA into C2C12 cells and induced C2C12 dif f erentiation. Ⅰn order to study the ef f ect ofRACK1gene silencing on the expressions of MHC and MyoG, we examined MHC and MyoG mRNA and protein expressions by using RT-qPCR, Western blot and immunof l uorescence methods. Ⅰn addition, the ef f ect of theRACK1silencing on the activation of pⅠ3K/Akt and Erk/MApK pathway was detected by Western blot analysis. The result showed thatRACK1-siRNA-2 had the highest interference efficiency, and its interference efficiency was approximately 70% at 48 h after the transfection. C2C12 myoblasts were transfected with siRNA-2 and induced into differentiation for 48 h and 72 h respectively. RT-qPCR showed that MHC and MyoG mRNA were significantly decreased in siRNA-2 transfected cells after 48 h of differentiation; Western blot and immunof l uorescence showed that MHC and MyoG protein were decreased after 72 h of dif f erentiation. However, no signif i cant changes in phosphorylation levels of Akt and Erk were observed. We conclude that downregulation ofRACK1by RNAi signif i cantly inhibits the expressions of MHC and MyoG, indicating thatRACK1is involved in positive regulation of C2C12 dif f erentiation.

Myoblast;RACK1; Myogenin; Myosin heavy chain; RAN interference

S814.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-03-106

2016-04-12；

2016-05-24

湖北省自然科学资助项目（2015CFB514）；湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划项目（T201508）

张晶（1985-），女，武汉人，博士，讲师，研究方向：骨骼肌发育和肌肉损伤的机制，E-mail:judyzhang1103@163．com

*通讯作者