大白菜抗/感干烧心材料CNGCs编码基因的差异解析

刘栓桃+张志刚+李巧云+王晓+王立华+赵智中+王淑芬+徐文玲+刘贤娴+刘辰

摘要：在植物中，環腺苷酸门通道（CNGCs）蛋白由一个大的基因家族编码，其参与K+、Na+ 和Ca2+等阳离子的非选择性吸收和转运，其中钙离子（Ca2+）是植物生长发育必需的营养元素和信号调节因子。在大白菜中，Ca2+缺乏易造成干烧心的发生，不同大白菜品种对干烧心的易感程度存在显著差异。本研究以极端抗/感干烧心大白菜自交系He102与06-247为试材，采用全基因组重测序的方法筛选到了6个编码CNGCs的结构变异基因，分别是Bra003081、Bra022702、Bra032132、Bra024067、Bra021265、Bra031529，其分别与拟南芥CNGCs成员1、4、6、9、19、20同源。对6个大白菜CNGCs的潜在跨膜区进行了预测，发现这些CNGCs包含5～8个跨膜区域，C-端均位于胞质一侧。对编码蛋白氨基酸序列进行了比较，结果表明，来自06-247的Bra003081和 Bra031529的C-端分别缺失389个氨基酸残基和多出43个氨基酸残基；Bra032132和Bra024067的变异也发生在06-247中，它们的C-端发生了2～3个氨基酸残基的插入或缺失；Bra021265和Bra022702的变异发生在He102中，前者是可变剪切，后者在N-端第31和第49氨基酸残基处分别缺失和插入一个氨基酸残基。易感干烧心材料06-247中四个突变CNGCs的突变位点都在编码蛋白的C-端，这有可能影响CNGCs的功能。该试验结果为下一步研究CNGCs基因功能、开发特异性标记、鉴定大白菜干烧心与CNGCs突变的关系奠定了基础。

关键词：大白菜；干烧心；环腺苷酸门通道；基因突变

中图分类号：S634.101文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）03-0010-06

AbstractIn plants， cyclic-nucleotide gated channels （CNGCs） are non-selective cation channels encoded by a large gene family. They can uptake and transport most cations such as Na+， K+ and Ca2+， among which， Ca2+ plays pivotal roles in the physiology and biochemistry of all plants. Calcium deficiency often causes tip-burn in Chinese cabbage. Different genotypes of Chinese cabbage have obvious differences in the sensitivity to tip-burn. In this study， re-sequencing was conducted in two genotypes of Chinese cabbage inbred lines， He102 and 06-247， which showed significant differences in tip-burn reaction. Six genes coding for CNGCs were screened out and showed coding-region differences between two lines. They were Bra003081， Bra022702， Bra032132， Bra024067， Bra021265 and Bra031529， which showed homologous to Arabidopsis CNGC1， 4， 6， 9， 19， 20 respectively. The potential transmembrane domains were predicted. These CNGCs contained 5～8 transmembrane domains and their C-terminals were all located in the inside of cell membrane. Amino acid sequence alignment showed that， Bra003081 and Bra031529， which mutated in 06-247， showed C-terminal large fragment deletion and small fragment elongation respectively； Bra032132 and Bra024067， also mutated in 06-247， showed only 2 to 3 amino acid insertion or deletion in C-terminal region； the mutation of Bra021265 and Bra022702 appeared in He102， in which， Bra021265 was alternative-splicing mutation while Bra022702 was single amino acid insertion/deletion mutation in N-terminal region. All the mutations of CNGCs in 06-247 appeared in the C-terminal region， which might influence their functions. The results provided clues for studying gene function of CNGCs， developing site-specific markers and exploring their relations to tip-burn in Chinese cabbage.

KeywordsChinese cabbage； Tip-burn； Cyclic-nucleotide gated channels （CNGCs）； Gene mutation

钙是植物必需的营养元素，其在细胞内以二价阳离子即Ca2+的形式存在，不仅对维持植物细胞壁和细胞膜结构的完整性至关重要，也是调节植物生长发育和应对环境胁迫的第二信使成分。Ca2+主要由植物的根系从土壤吸收，即主要经根尖及成熟区根毛的表皮穿越根的外皮层细胞进入内皮层，最后进入中柱，经质外体或共质体途径运输至地上部分。可见植物对Ca2+的吸收是个复杂过程，导致植物缺钙的原因不仅有环境因素如土壤酸化、环境温度等，更有植物自身的原因。唐文浩等[1]研究发现，不同辣椒品种对营养液中Ca2+浓度变化敏感程度有显著差异，不敏感型品种在一定供Ca2+条件下，外界环境Ca2+营养水平的高低对辣椒果实Ca2+累积量无显著影响，说明不敏感型品种对Ca2+营养环境变化耐性较高，自身调控能力强，推测与品种自身的Ca2+吸收特性有关。本课题组在多年大白菜品种比较试验中观察发现，同地块不同大白菜品种，其干烧心程度存在显著差异，有的品种在各种地块上种植从不发生干烧心现象，而有的品种则在相同条件下年年出现干烧心。由此推测，不同干烧心易感程度的大白菜材料在钙吸收和运输系统中可能存在差异。在钙的吸收转运过程中，作为非选择性阳离子通道（non-selective cation channels，NSCCs）重要组成的环腺苷酸门通道 （cyclic-nucleotide gated channels，CNGCs） 蛋白起重要的作用[2-5]。我们以两个极端抗/感干烧心大白菜自交系为试材，采用全基因组重测序方法筛选编码CNGC的差异基因，并对其进行详细解析，旨在为下一步鉴定基因功能、开发功能性标记、采用QTL定位技术筛选与抗/感干烧心紧密连锁的分子标记奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

本研究所用材料为极端易感干烧心大白菜材料06-247，从日本大白菜一代杂交种健春的自交后代中分离；极端抗干烧心大白菜材料He102为地方品种河南二包头后代的分离自交系。

1.2CNGCs结构差异基因的筛选

全基因组重测序委托百迈客公司进行，将两材料间的差异基因按swissprot_annotation和GO_annotation功能注释分别排序，筛选两项内容中包含cyclic nucleotide-gated ion channel的变异位点，获得变异基因的基因ID信息。

1.3CNGCs差异基因的电子克隆及序列比对

从网站 http：//brassicadb.org/brad/[6]下载大白菜全基因组序列信息，利用网站的search gene 功能获得变异基因的物理位置，从大白菜基因组序列信息中将对应的基因序列拷贝到记事本文档即完成对变异基因参考序列的电子化克隆。对应基因的编码区参考序列直接从BRAD数据库中下载获得。变异基因的突变序列则根据重测序提供的变异信息手动修改完成。各种类型的序列比对均用DNAMAN软件运行。

1.4CNGCs跨膜区预测

跨膜区预测在网站http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html上进行。

2结果与分析

2.1环腺苷酸门通道差异基因的筛选

按功能注释排序后，发现了10个差异位点的注释信息含cyclic nucleotide-gated channel或putative cyclic nucleotide-gated channel，对应6个基因，它们是Bra021265、Bra031529、Bra022702、Bra024067、Bra032132和Bra003081，分别位于A01、A02、A03、A04和A10五条染色体上。Bra022702是双位点变异，Bra003081有四处变异位点，其余四个基因是单位点变异。变异类型有移码突变、可变剪切、密码子插入/删除等。Bra021265和Bra022702的突变发生在He102中，其余4个基因的突变发生在06-247中（表1）。

2.2差异基因在抗/感干烧心材料间的序列比较

Bra021265是一个可变剪切类的变异基因，该基因编码区参考序列全长2 229 bp，包含11个外显子，编码743个氨基酸残基，与拟南芥CNGC19同源。He102的Bra021265在第六内含子与第七外显子之间插入了一个碱基，该碱基位于第六内含子剪切受体位点，有可能影响基因的正常剪切。06-247与He102的Bra021265序列差异如图1所示。

Bra031529基因编码区参考序列长2 274 bp，包括11个外显子，编码758个氨基酸殘基，与拟南芥CNGC20同源。在06-247中，该基因编码区第11个外显子中插入了一个碱基A（图2A），导致06-247的编码产物发生移码突变而不能正常终止。经软件预测，变异后的基因在3′端非翻译区126～128 bp之间有一个终止密码子，致使突变基因编码区长2 406 bp，编码产物比参考基因长43个氨基酸残基，差异主要在蛋白的C-端（图2B）。

Bra022702包含8个外显子，与拟南芥CNGC4同源。测序结果表明He102的Bra022702在第一外显子处有两处突变，在不足50 bp的范围内同时缺失一个密码子和插入一个密码子（图3A），而06-247没有发生突变。二者编码产物总氨基酸数目不变，都包含695个氨基酸残基，变异区域介于第31～50个氨基酸残基之间（图3B），变异位于编码蛋白的N端。

Bra024067的编码区参考序列长2 136 bp，包括5个外显子，与拟南芥CNGC9同源。基因变异发生在06-247中，在编码区第658个密码子后插入了3个密码子（图4A），导致其编码产物比He102多3个氨基酸残基（图4B）。

Bra032132參考基因编码区长2 238 bp，包含7个外显子，编码746个氨基酸残基，与拟南芥CNGC6同源。突变发生在06-247中，在第680个密码子后缺失了两个密码子（图5A），导致变异基因少两个氨基酸残基（图5B）。

Bra003081的参考基因编码区长2 274 bp，包括6个外显子，编码产物长758个氨基酸残基，与拟南芥CNGC1同源。四处变异均发生在06-247中，在不足20 bp的范围内有四处移码突变（图6A），导致突变基因的编码区长2 275 bp。移码突变使翻译产物提前终止，C-端缺失389个氨基酸残基，只编码产生含369个氨基酸残基的蛋白（图6B）。

2.3差异基因跨膜区预测

CNGCs属于跨膜蛋白，本研究用在线软件对差异基因的跨膜区进行了预测，这些基因分别有5～8个跨膜区不等，C-端位于胞质一侧，长短不等。具有5～6个跨膜区的CNGC其膜内侧区域较长，而具有8个跨膜区的CNGC则C-端较短。详细结果见表2。

3讨论与结论

植物对钙的吸收转运是个复杂的过程，一方面，植物对钙的吸收受环境的影响，如土壤干旱、盐碱化；另一方面，不同基因型的植物由于钙吸收转运基因的变异导致在相同环境下对钙的吸收存在差异。后者在育种工作中意义较大。参与钙吸收转运的基因众多，其中CNGCs是一类重要的非选择性阳离子通道蛋白，参与植物Ca2+的吸收和转运，也参与Na+、K+等一价阳离子的吸收和转运。在植物中，人们已从大麦（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）等物种中克隆到CNGCs基因[7]。模式植物拟南芥CNGCs家族有20个基因（CNGC1～CNGC20）。CNGCs是一类跨膜的通道蛋白，C-端是调控区，位于膜内胞质一侧，此区域既可被环核苷酸结合后激活，又可被钙调素竞争结合后失活[8]。本研究从大白菜两材料中发现了6个CNGCs变异基因，其中4个（Bra031529、Bra024067、Bra032132和Bra003081）的变异均造成C端结构变异，有可能影响其功能。尤其是Bra003081，与拟南芥CNGC1同源性最高，其C端有大段的缺失，这有可能导致其调控区完全丧失，从而影响其对Ca2+的转运。因为有研究表明，拟南芥CNGC1在根部高水平表达，其功能缺失突变

造成地上部分Ca2+含量显著少于野生型[9]。Bra022702、Bra032132、Bra024067分别与AtCNGC4、AtCNGC6和AtCNGC9同源，其中，AtCNGC4与AtCNGC6都有参与Ca2+转运的报道[10，11]，AtCNGC9的功能研究未见报道。Bra021265和Bra031529分别与AtCNGC19和AtCNGC20具有较高的同源性，AtCNGC19在根部表达，而AtCNGC20则主要在叶脉周围高水平表达[12]。

本研究筛选到的大白菜CNGCs结构变异基因，均可以根据其核酸序列的差异特点开发成一定类型的分子标记，用于研究双亲衍生群体中干烧心性状的QTL定位，为下一步的深入研究奠定基础。

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