鼠李糖乳杆菌与嗜热链球菌复配发酵乳的工艺优化

(新希望乳业控股有限公司产品研发中心，成都610063)

鼠李糖乳杆菌与嗜热链球菌复配发酵乳的工艺优化

曾丽萍，王欣璐，李启明，聂远洋

(新希望乳业控股有限公司产品研发中心，成都610063)

通过研究分离自新疆传统酸骆驼奶中的鼠李糖乳杆菌grx10的发酵特性，将鼠李糖乳杆菌grx10与不同发酵特性的嗜热链球菌复配制作发酵乳，优化了鼠李糖乳杆菌grx10的最适接种量和最适发酵温度，评价了复配发酵乳的发酵特性、质构特性和感官品质，并测定了其乳酸菌活菌数。结果表明，优化后的发酵工艺参数为：鼠李糖乳杆菌grx10与嗜热链球菌st447复配，鼠李糖乳杆菌grx10的最适接种量为4%，最适发酵温度为42℃，发酵时间为5 h，按照此工艺制得的发酵乳的总活菌数为1.32×109mL-1，鼠李糖乳杆菌grx10的活菌数为8.40×108mL-1，且口感、风味和整体品质俱佳，能同时满足生产工艺及消费者对产品的需求。

发酵乳；工艺优化；鼠李糖乳杆菌；嗜热链球菌

0 引言

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnose)是一种能够利用发酵性糖类产生乳酸的益生菌，具有抑制肠道中有害菌生长、降低血清胆固醇、提高免疫力等生理功能。

笔者实验室就从新疆传统酸骆驼奶中分离筛选到一株鼠李糖乳杆菌，体外实验和动物实验证明该菌株能耐受胃酸和胆汁酸，具有显著的降低血清胆固醇功效。但研究表明，只有当每天摄取的益生菌数量达到108～109才具有保健功效，而大多益生菌的发酵特性差不利于高活菌数益生菌产品的工业化和市场推广。本研究对新疆酸骆驼奶中筛选到的鼠李糖乳杆菌的发酵特性进行研究，优化发酵工艺，以期在不添加食品添加剂的条件下得到一款鼠李糖乳杆菌活菌数达到保健要求且品质稳定、良好口感的发酵产品，为进一步推广应用奠定基础。

1 实验

1.1菌种

鼠 李 糖 乳 杆 菌 grx10（Lactobacillus rhamnosus grx10），一株分离自新疆传统乳制品中具有降胆固醇功效的专利菌种（专利号：CN101328470），由河北一然生物科技有限公司代加工成冻干菌粉；嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）st079，st447，st071，st328，st338，st077，st073，st446。

1.2主要试剂与仪器

MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，CH3COONa 5 g，K2HPO42 g，MgSO4· 7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.2 g，半胱氨酸盐酸盐0.5 g，吐温80 1 mL，蒸馏水1 000 mL，调pH值至6.2～6.4。

全自动生长曲线分析仪，物性测试仪（TA.XTPlus），恒温培养箱（SPX-150BSH-II）、超净工作台（SW-CJ-2FD）、pH计（梅特勒FE20）等。

1.3方法

1.3.1 接种菌液的制备与活化

分别称取鼠李糖乳杆菌grx10冻干菌粉2 g至50 mL 40℃灭菌水中和嗜热链球菌冻干菌粉0.25 g至100 mL 40℃灭菌水中，摇匀并孵育10 min制成接种菌液。发酵接种量按接种的灭菌乳体积计算。

1.3.2 益生菌发酵乳制备工艺流程

配料（原料乳预热至55℃加入质量分数为8%白砂糖和1.5%乳清蛋白粉充分溶解）→均质（20～25 MPa）→杀菌（90℃，10～15 min）→冷却至37℃→接种→发酵至凝乳（发酵温度为37℃，发酵终点pH值为4.5左右）→后熟（4℃，12 h）。所用菌种和接种量如表1所示。

表1 实验用菌种

1.3.3 鼠李糖乳杆菌grx10单株菌发酵性能测定

生长曲线测定：取1.3.1制备的鼠李糖乳杆菌grx10接种液按3%的接种量接入已灭菌的MRS培养基中，混匀。在Bioscreen全自动生长曲线分析仪的检测孔板中，每孔加入300 μL上述已接种培养基，并做三个重复孔[8]，将已加样的检测孔板置于Bioscreen全自动生长曲线分析仪中，37℃静置培养20 h，每2 h自动扫描读取每个加样孔的A600值。

酸化曲线测定：将1.3.1制备的鼠李糖乳杆菌grx10接种液按3%的接种量接入已灭菌的酸奶发酵基料中，混匀后分装于10个灭菌瓶中，37℃下静置发酵，每隔2 h测定其pH值和滴定酸度，以培养时间为横坐标，pH值和滴定酸度为纵坐标，绘制鼠李糖乳杆菌grx10的生长曲线。

1.3.4 与鼠李糖乳杆菌grx10复配发酵的最适嗜热链球菌的筛选

将1.3.1制备的鼠李糖乳杆菌grx10和嗜热链球菌接种液按表1分别接入已灭菌的酸奶发酵基料中，混匀后在37℃下静置发酵，至pH值达到4.5时终止发酵并记录凝乳时间，然后置于4℃下后熟12 h，进行pH值和滴定酸度测定、质构测定、感官评定并在光学显微镜下观察乳酸菌形态，根据结果筛选最优发酵组合。

1.3.5 鼠李糖乳杆菌grx10最适接种量的优化

分别称取4 g鼠李糖乳杆菌grx10冻干菌粉溶于50 mL灭菌水中，摇匀制备成接种液，同1.3.1制备的嗜热链球菌接种液一起接种于已灭菌的酸奶发酵基料中，混匀后在37℃下静置发酵，至pH值达到4.5时终止发酵并记录凝乳时间，然后置于4℃下后熟12 h，进行pH值和滴定酸度测定、质构测定、感官评定并在光学显微镜下观察乳酸菌形态，根据结果确定最适的鼠李糖乳杆菌grx10接种量。

1.3.6 最适发酵温度的优化

按最适接种量取鼠李糖乳杆菌grx10与嗜热链球菌一起接种于已灭菌的酸奶发酵基料中，混匀后在37℃下静置发酵，至pH值达到4.5时终止发酵并记录凝乳时间，然后置于4℃下后熟12 h，进行pH值和滴定酸度测定、质构测定、感官评定并在光学显微镜下观察乳酸菌形态，根据结果确定最适发酵温度。

1.3.7 发酵乳酸度和pH值的测定

采用氢氧化钠直接滴定法测定酸度，用pH计测定pH值[9]。

1.3.8 发酵乳质构测定

采用物性测试仪测定发酵乳的质构特性，使用P0.5探头（直径0.5英寸的圆柱形探头），测前速度0.5 mm/s，测后速度10.0 mm/s，感受力10 g，返回距离30 mm，测定样品的黏度、坚实度和稠度指标。样品均重复测定三次[10-12]。

1.3.9 感官评定方法

感官评定小组由10名具有乳制品感官评定知识背景的人组成，以表观特性、气味、质地、风味、酸甜比作为主要评价指标。组织、状态测定：取适量样品置于洁净的平板中，在自然光下观察色泽、组织状态及切面；风味、口感测定：先闻气味，温开水漱口后品尝样品[13]。

1.3.10 菌落计数

参照国标GB 478935－2010的方法检测发酵乳中的乳酸菌活菌数。

2 结果与讨论

2.1鼠李糖乳杆菌grx10单株菌的生长曲线和酸化曲线

鼠李糖乳杆菌grx10在培养2 h后进入对数期，在2～10 h内，菌液OD600nm值迅速升高。从12 h开始，菌体培养进入稳定期，鼠李糖乳杆菌grx10的生长曲线如图1所示。

图1 鼠李糖乳杆菌grx10的生长曲线

发酵实验结果表明，鼠李糖乳杆菌grx10的酸化速度比较缓慢，从4 h开始，酸度才有开始明显提高，在4～12 h内酸度上升较快，到12 h时酸度达到75°T，鼠李糖乳杆菌grx10的酸化曲线如图2所示。

图2 鼠李糖乳杆菌grx10的酸化曲线

由图1与图2的结果发现，当鼠李糖乳杆菌grx10的生长进入对数期时其酸度也明显开始上升，鼠李糖乳杆菌grx10的生长曲线与酸化曲线的变化基本一致。分析原因可能是随着鼠李糖乳杆菌grx10的生长繁殖，代谢产物（如乳酸等）不断积累，整个发酵体系的酸度也随之升高[14]。

2.2不同嗜热链球菌与鼠李糖乳杆菌grx10复配发酵

不同嗜热链球菌与鼠李糖乳杆菌grx10复配发酵后样品的凝乳时间、酸度、pH、感官指标如表2所示。方差分析结果表明，鼠李糖乳杆菌grx10与嗜热链球菌进行复配发酵，凝乳时间差异显著，其中纯鼠李糖乳杆菌grx10发酵时间最长达12 h，与嗜热链球菌进行复配发酵后，发酵时间显著缩短（P＜0.05），与不同的嗜热链球菌复配发酵的时间也存在差异，其中I组的发酵时间最短，但滴定酸度、凝乳pH值均差异不显著（P＞0.05）。表2中，发酵产品的感官指标均存在明显差异，其中A、B、E、F、H组的产品均质地粗糙松散，C、D、G均风味平淡无特色，只有I组质地细腻、口感柔和且有明显的grx10发酵风味。

不同嗜热链球菌与鼠李糖乳杆菌grx10复配发酵酸奶的质构特性结果如表3所示。表3中，各组样品的硬度从大到小为B＞D＞H＞C＞I＞E＞F＞G＞A，即纯鼠李糖乳杆菌grx10发酵样品的硬度最小，与嗜热链球菌复配发酵样品硬度均明显提高，且B、C、D、H组均达到显著水平（P＜0.05）；各组的稠度从大到小为D＞B＞C＞H＞I＞E＞F＞G＞A，即纯鼠李糖乳杆菌grx10发酵样品的稠度最小，除了F、G两组其于组的稠度均较A组显著提高（P＜0.05）。黏聚性是用于模拟样品的内部粘合力，各组的黏聚性大小为D＞C＞G＞I＞B＞H＞E＞F＞A，即纯鼠李糖乳杆菌grx10发酵样品的黏聚性最小，除了F组其于组样品的黏聚性均显著高于A组（P＜0.05）；黏性是模拟探头与样品接触时用于克服两者表面间吸引力所需工作，即反映了样品的黏着性，各组的黏性指数大小为D＞C＞B＞I＞G＞H＞E＞F＞A，即A组的黏性指数最小，且显著小于其于组（P＜0.05）。

表2 不同嗜热链球菌与鼠李糖乳杆菌grx10复配发酵结果

表3 不同嗜热链球菌与鼠李糖乳杆菌grx10复配发酵酸奶的质构特性

综合各组的发酵特性、感官品评指标以及发酵乳质构特性指标发现，虽然纯种鼠李糖乳杆菌grx10发酵时间长、风味难以让人接受、质构指标也差，但是与嗜热链球菌复配发酵后，发酵特性、风味与质构均得到了显著改善，不同组之间也存在明显差异。各组虽发酵时间均显著缩短，但是B、E、F、H组均口感粗糙、质地松散且质构大多指标均差，C、D组虽硬度、稠度、黏聚性和黏性指数均高于明显高于其它组，但是风味平淡且太粘稠。分析原因可能是，鼠李糖乳杆菌grx10发酵速率慢，产胞外多糖少，发酵乳黏度低有颗粒感，C、D、I组的嗜热链球菌能产生较多胞外多糖，影响酪蛋白间的相互链接方式，对酪蛋白微球立体网状结构的构建产生影响，进而影响凝胶结构的形成，改善了发酵乳的质地，同时鼠李糖乳杆菌grx10与嗜热链球菌能协同生长，从而缩短了发酵时间。综合以上结果，与鼠李糖乳杆菌grx10复配发酵益生菌酸奶的最适菌种为嗜热链球菌st447。

2.3鼠李糖乳杆菌grx10最适接种量的确定

选用嗜热链球菌st447与鼠李糖乳杆菌grx10进行复配发酵，不同接种量发酵的凝乳时间、酸度、pH值、感官指标如表4所示。方差分析表明，接种量对凝乳时间有显著影响，其中A组的凝乳时间显著长于B组和C组（P＜0.05），但是B组和C组无差异；滴定酸度、凝乳pH值均差异不显著（P＞0.05），三个样品的口感差异不显著，均质地细腻、口感顺滑，但是B组鼠李糖乳杆菌grx10发酵风味更柔和且优于A组和C组，A组的风味太平淡而C组的鼠李糖乳杆菌grx10发酵风味太浓烈。

表4 不同接种量的鼠李糖乳杆菌grx10发酵结果

不同接种量鼠李糖乳杆菌grx10发酵乳的质构特性结果如表5所示。由表5可以看出，接种量对发酵乳质构无明显影响，均未达到显著水平（P＞0.05）。

表5 不同接种量的鼠李糖乳杆菌grx10发酵乳的质构特性

综合各组的发酵特性、感官品评指标以及发酵乳质构特性指标发现，鼠李糖乳杆菌grx10接种量的增加能缩短发酵时间，对口感和质构指标无显著影响。但是，随着鼠李糖乳杆菌grx10添加量的增加能明显提高鼠李糖乳杆菌grx10的发酵风味，不过当接种量为6%时其发酵风味太浓烈，使得样品整体风味不太柔和。综合以上结果，鼠李糖乳杆菌grx10的最适接种量为4%。

2.4最适发酵温度的确定

接种嗜热链球菌st447与鼠李糖乳杆菌grx10进行复配发酵，不同温度下发酵的凝乳时间、酸度、pH值、感官指标如表6所示。方差分析结果表明，在42，37，33℃下复配发酵，凝乳时间差异极显著（P＜0.01），凝乳时滴定酸度、pH值均差异不显著（P＞0.05）。但发酵产品感官存在明显差异，随着发酵温度的降低黏稠度逐渐增加，鼠李糖乳杆菌grx10的发酵风味也逐渐变浓，但是42℃时风味最柔和且还有浓浓的奶香。

不同发酵温度下的复配发酵乳质构特性如表7所示。由表7可以看出，温度除了对发酵产品的黏聚性没显著影响外，对硬度、稠度、黏性指数均存在显著影响（P＜0.05），但37℃与33℃除了稠度达到显著差异（P＜0.05），其他指标均无显著差异（P＞0.05），且硬度、稠度和黏性指数均随温度的降低而减小。

综合各组的发酵特性、感官品评指标以及发酵乳质构特性指标发现，提高发酵温度能有效缩短发酵时间，改善质构特性，且在42℃时风味最佳。综合以上结果，复配发酵乳的最适发酵温度为42℃。

2.5最终发酵产品的活菌数测定

表6 不同温度下的复配发酵乳发酵结果

表7 不同发酵温度对复配发酵乳质构特性的影响

鼠李糖乳杆菌grx10与嗜热链球菌按4%接种量在42℃下复配发酵，产品活菌数计数结果见图3，其总活菌数为1.32×109/mL-1，嗜热链球菌的活菌数为4.80×108/mL-1，鼠李糖乳杆菌grx10的活菌数为8.40×108/mL-1。由此可见，经工艺优化后，复配发酵乳的益生菌活菌数已达到起保健功效的要求。

图3 复配发酵乳产品最终活菌数

3 结论

本研究对新疆传统的酸骆驼奶中分离出的一株具有降低血清胆固醇功效的鼠李糖乳杆菌grx10的发酵特性进行研究发现，由于其发酵时间长、产酸慢，采用纯种发酵其口感和风味差等原因，极不利于该菌株的工业化应用和市场推广。因此通过研究鼠李糖乳杆菌grx10与不同发酵特性的嗜热链球菌复配发酵，优化了鼠李糖乳杆菌grx10的最适接种量和最适发酵温度，最终确定其发酵工艺条件为：鼠李糖乳杆菌grx10与嗜热链球菌st447复配，鼠李糖乳杆菌grx10的最适接种量为4%，发酵温度为42℃，发酵时间为5 h，最终发酵产品总活菌数为1.32×109/mL-1，鼠李糖乳杆菌grx10的活菌数为8.40×108/mL-1，通过感官分析并结合物性测试仪测定产品的质构特性等，表明复配发酵乳的口感、风味和整体品质俱佳，既达到保健功效作用又达到市售酸奶品质、口感要求，并且配料简单、无添加任何食品添加剂，满足了消费者对健康食品的需求。

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Technological optimization of mixed fermented milk prepared by Lactobacillus rhamnosus and Streptococcus thermophiles

ZENG Liping,WANG Xinlu,LI Qiming,NIE Yuanyang
(Product Research Center,New Hope Dairy Holdings co.LTD,Chengdu 610063,China)

The aim of this experiment is to evaluate the mixed fermented milk which is fermented by Streptococcus thermophilus with different fermentation characteristics and Lactobacillus rhamnosus named grx10 which was isolated from camel yogurt in Xinjiang.By optimizing inoculation and fermentation temperature,we measured fermentation characteristics,texture properties,sensory quality,and its viable count of Lacticacid bacteria.The results showed that the optimal inoculation of Lactobacillus rhamnosus were 4%when it was fermented with Streptococcus thermophilus,the fermentation temperature was 42℃ and fermentation time was 5 h,the number of viable Lactobacillus rhamnosus was 8.40×108/ mL-1.Moreover,sensory evaluation results showed that,the taste and flavor of grx10 yogurt was well,which can satisfy both production and consumer’s demand.

fermented milk;technological optimization;Lactobacillus rhamnosus;Streptococcus thermophilus

TS252.54

A

1001-2230（2017）02-0047-04

2016-06-07

国家科技支撑计划课题(2012BAD12B04)；四川省国际科技合作与交流研究计划(2016HH0056)。

曾丽萍（1989-），女，硕士，从事乳品微生物方面的研究。

聂远洋