瘤胃原虫在瘤胃内建立及其研究进展

彭宏刚，陈翔宇，刘艳丰*，张 玲

（1．新疆库尔勒市库尔楚园艺场，新疆 库尔勒 841000，2.新疆畜牧科学院，新疆 乌鲁木齐 830000）

瘤胃原虫在瘤胃内建立及其研究进展

彭宏刚1，陈翔宇2，刘艳丰2*，张 玲2

（1．新疆库尔勒市库尔楚园艺场，新疆 库尔勒 841000，2.新疆畜牧科学院，新疆 乌鲁木齐 830000）

反刍动物瘤胃内大量原虫，对于饲料营养物质在瘤胃内的发酵分解，维持微生态环境的稳定等方面起着十分重要的作用。本文综述了瘤胃原虫区系在反刍动物瘤胃内建立，瘤胃原虫的营养来源、对瘤胃内环境的影响和分子生物技术在瘤胃原虫中的应用。

瘤胃；原虫；纤毛虫；研究进展

10.16863 /j.cnki.1003-6377.2017.05.002

反刍动物瘤胃内寄生了非常丰富的微生物，主要包括细菌、原虫和真菌等。这些微生物在发酵和分解饲料中营养物质，稳定瘤胃内微生态环境等方面，发挥着重要的作用。瘤胃微生物中的原虫，主要是纤毛虫纲 （Ciliates），还有鞭毛虫纲 （Falgellatet）等，纤毛虫主要是全毛虫 （Holotrich Protozoa）和贫毛虫（Entodiniomorphid Protozoa）。原虫可以促进饲料中蛋白质类的消化、吸收和利用，但抑制脂类和糖类的消化、吸收和利用；对维生素类和矿物质类物质的消化、吸收和利用也有影响（Jounay，1996）[1]。因此，研究瘤胃原虫对反刍动物瘤胃消化代谢体系的作用机理对挖掘和掌握微生物对反刍动物营养与饲料科学资源开发具有重要的意义。

1 原虫区系的建立

1.1 幼龄反刍动物的瘤胃原虫

幼龄反刍动物获得原虫最直接和最主要的途径是与成年动物的直接接触，当母畜舔食幼畜时，母畜口腔内的原虫能直接传给幼畜。幼龄反刍动物及时接触或采食被原虫区系完善的反刍动物接触过的物体或牧草上留下唾液，也能间接地获得原虫。第三个途径是通过气溶胶的形式，一些原虫间接传播给幼龄反刍动物。出生后立即隔离的犊牛和羔羊体内无法快速建立原虫区系。

随着幼龄反刍动物的生长，瘤胃生理环境逐渐稳定有利于原虫的建立。在初生后3～6周前，给幼畜饲喂饲料，幼畜的瘤胃活动力、瘤胃壁吸收力、唾液分泌均会发生变化，引起瘤胃内pH值出现波动，当瘤胃中pH值降至5.0，可以阻碍原虫区系的建立。Fonty等（1988）[2]研究无菌隔离对羔羊瘤胃纤毛虫的建立的影响发现，瘤胃中良好的细菌区系的早期形成是建立纤毛虫区系的前提。

1.2 无原虫反刍动物原虫区系的建立

研究不同环境对瘤胃功能影响的常用方法是给无原虫反刍动物接种定量和已知的某原虫，建立一个一定浓度的原虫区系，但原虫区系所需建立时间因接种量和动物种类而异。Williams和Dinuson(1972)[3]在去原虫犊牛瘤胃内接种内毛虫或全毛虫，接种了20～50个原虫细胞的犊牛5～7周后的瘤胃内纤毛虫浓度相当于接种了1万～9.4万个细胞的1～2周水平。一头去原虫犊牛与成年山羊一起饲养16周后，犊牛瘤胃内原虫浓度与山羊瘤胃内的原虫浓度相当。Williams和Wither(1993)[4]在4头去原虫绵羊瘤胃中重新接种1 000个清洗过的原虫细胞，11 d后4头绵羊瘤胃内纤毛虫浓度皆大于105个/g内容物，主要类型为内毛虫属原虫。

2 瘤胃内纤毛虫的营养来源

2.1 淀粉对瘤胃原虫的影响

淀粉是瘤胃内纤毛虫，尤其是贫毛虫的主要营养来源。贫毛虫可以快速采食淀粉，直至其细胞内充满淀粉才停止采食，采食后的淀粉被原虫储存后慢慢发酵。原虫和细菌发酵淀粉的作用机理是有差异的，在原虫体内，淀粉是以颗粒的形式储存，缓慢发酵生成乙酸和丙酸等短链脂肪酸，直接通过瘤胃壁被反刍动物吸收，小部分经小肠吸收；在细菌体内，淀粉被快速发酵生成乳酸而沉积(Newbold,1985)[5]。纤毛虫的这种淀粉储存形式不仅稳定了瘤胃pH值和渗透压，还能减少淀粉快速发酵引起反刍动物宿主的酸性中毒的危害，对调控瘤胃的发酵模式具有重要意义。但驱除纤毛虫后，淀粉在消化道内总的消化率没有改变，只是其消化从瘤胃转移至小肠(Mendoza,1993)[6]，也有报道，有没有纤毛虫对淀粉的消化无明显影响。

2.2 纤维素对瘤胃原虫的影响

纤毛虫直接参与降解细胞壁多糖的过程。一些大型纤毛虫，如：前毛虫、头毛虫和双毛虫等是瘤胃内降解纤维物质的主力军，能在没有淀粉的情况下利用纤维素生长。纤毛虫消化和降解纤维素的两种主要方式，一是纤毛虫将植物组织直接进行物理性裂解，使植物细胞壁破裂成碎片，导致细胞分离，分离的细胞和碎片被纤毛虫直接吞噬消化；还有一种方式是纤毛虫分泌可以分解纤维素、半纤维素和果胶等的分解酶，从而直接降解细胞壁多糖。

2.3 氨基酸对瘤胃原虫的影响

纤毛虫不能直接利用植物蛋白等含氮物质，但能吞噬瘤胃内细菌，摄取其游离氨基酸及植物蛋白等来合成自身的氨基酸，满足纤毛虫对氮的需要。植物中可溶性蛋白质和不溶性蛋白颗粒都能被纤毛虫降解，如不溶性颗粒鱼粉、菜籽饼等植物蛋白也可被纤毛虫分解（Ushida和Jouany,1985）[7]。纤毛虫被全部驱除后，瘤胃内氨浓度降低，主要原因是纤毛虫有非常强的脱氨基作用，脱氨基产生的氨贮存在瘤胃液内。

2.4 矿物质等营养元素对瘤胃原虫的影响

矿物质和维生素是纤毛虫生长的必需元素。纤毛虫对胆碱影响较大，当纤毛虫被全部驱除后，胆碱的吸收受到明显抑制，但内源胆碱增加。內源胆碱增加是由于纤毛虫被驱除减少，使蛋氨酸含量的增加，蛋氨酸为內源胆碱合成提供了甲基供体，內源胆碱的合成增加。

3 纤毛虫对瘤胃内环境的影响

3.1 纤毛虫对瘤胃pH值的影响

恒定的pH值是瘤胃微生物的正常生长、发育及瘤胃正常发酵作用的前提。纤毛虫对pH值的恒定具有十分重要的作用，主要的作用机制是纤毛虫吞噬瘤胃内可溶性糖类（葡萄糖、麦芽糖、蔗糖及可溶性淀粉等），以淀粉和多聚葡萄糖的形式贮存，降低细菌对可溶性糖类的爆发性快速发酵引起pH的变化。

3.2 纤毛虫对瘤胃VFA的影响

瘤胃中有原虫时，瘤胃发酵产生的总VFA、NH3、CO2、甲烷等浓度较高，饲粮发酵类型以低丙酸高丁酸发酵为主。瘤胃中原虫驱除后，瘤胃发酵产生的丙酸、总VFA生成量和比例增加，而丁酸、乙酸的比例下降，减少甲烷产生量，饲粮发酵类型为高丙酸发酸。体外培养时也证实纤毛虫产生大量的乙酸、乳酸、丁酸、氢和CO2，但丙酸含量较少。

3.3 纤毛虫对瘤胃NH3-N浓度的影响

瘤胃中氨氮浓度对反刍动物的蛋白质消化吸收具有重要的影响。绵羊有无原虫，瘤胃氨氮浓度和丁酸差异很大，绵羊无原虫时，瘤胃氨氮浓度和丁酸比例降低，微生物氮与饲料的流出量增加。有研究证明，去原虫可降低饲料和细菌蛋白的降解率，使瘤胃氨氮浓度明显下降。也有研究表明，瘤胃NH3-N浓度对蛋白质降解速度和降解程度无影响，去原虫减少瘤胃内蛋白质降解的机制与蛋白质的溶解度有关。

3.4 纤毛虫对瘤胃甲烷产量的影响

反刍兽甲烷杆菌和甲酸甲烷杆菌是产甲烷的主要菌，产甲烷菌大部分属于细菌。作用原理是：产甲烷菌和纤毛虫是兼性协同关系，在瘤胃中，产甲烷菌黏附纤毛虫上，以纤毛虫代谢产物H2和瘤胃中厌氧发酵产生的CO2为原料，在氢化酶的作用下合成甲烷和水。纤毛虫产生的氢气是瘤胃内合成甲烷的主要来源，而且有些纤毛虫本身就是产甲烷菌，因此，原虫是反刍动物瘤胃内间接和直接的产甲烷体。试验证明，驱除瘤胃原虫，导致产甲烷菌就失去了黏附的底物，产甲烷菌减少和没有瘤胃原虫可导致甲烷产量明显下降。Kittelmann等(2013)[8]采用经典的第二代测序法（454高通量焦磷酸测序法）测定奶牛、绵羊和红鹿的瘤胃微生物群落，发现瘤胃原虫与Black Rhino组厌氧真菌呈负相关关系，差异显著。

4 分子生物学技术在瘤胃原虫研究中的应用

分析瘤胃原虫时，采用DNA多态性，可以避免由于原虫虫体微小、形态相似而无法准确区分的困难，使瘤胃微生态的研究变得更为简单和精确。随机扩增多态DNA、指纹图谱 (RAPD)、同位素示踪、Real-Time PCR、变性梯度凝胶电泳和荧光原位杂交等分子生物学技术随着技术的成熟，在瘤胃原虫的研究上应用越来越多，从基因、分子层次研究纤毛虫的类型和种类、丰度等，对反映瘤胃的真实现状提供更加可靠而丰富的依据。近年来发展的新的研究技术-高通量测序和代谢组学等方法更进一步丰富了原虫的研究手段。

Shin等(2004)[9]用18S rRNA片段测序技术发现在瘤胃液分离出的可识别克隆片段中，内毛虫为主，含量为69.6%，其次是贫毛虫，为31.4%，不到1/3；同时发现约1/3的克隆片段是Gene Bank没有的，需要进行深度挖掘。Karnati等(2003)[10]采用专一性的原虫引物(P.SSU-342f)和18S rRNA/PCR两种方法测定和对比了瘤胃原虫的基因序列，表明，所有的克隆序列和Gen Bank的序列同源性达到93%～99%。

Hristov等（2001）[11]用同位素示踪法测定微生物蛋白分解酶活力，N14标记的酪蛋白作为瘤胃微生物的氮源测定原虫活性。

实时PCR(Real-Time PCR)可以估测瘤胃原虫数量。Sylvester等[12](2005)用Real-time PCR定量技术分析瘤胃原虫氮，发现原虫氮占了瘤胃微生物氮的4.8%～12.7%。Skillman等(2006)[13]采用实时PCR技术定量技术分析瘤胃中内毛虫属（饲喂基础日粮为干草的绵羊），发现内毛虫属占瘤胃原虫总量的98%，但个体间存在差异。Regensbogenova等(2004)[14]对绵羊饲喂相同日粮，发现纤毛虫种类个体差异很大，但同一个体的瘤胃中不同部位纤毛原虫种类差异很小；进一步研究表明，同一绵羊饲喂不同的日粮，瘤胃原虫的种类差异很大。

在微生物区系结构变化监测中，荧光原位杂交(Fluorescenc in situ hybridization,FISH)技术的应用也很多。独立的微生物细胞可以用荧光标记的寡核苷酸探针来探测。研究者用荧光原位杂交技术定量了瘤胃中总产甲烷菌，发现甲烷微菌属占54%，还测定了不同反刍动物瘤胃中颤螺菌的含量。

DNA芯片技术是一项融合了微电子学、生物学和计算机技术设计等的分子生物学分析方法。DNA芯片技术主要用于医学和分子生物学，随着技术融合，也用于瘤胃微生物区系的研究。这种分析方法优势是操作简单，信息含量大，可一次性获得大量瘤胃微生物区系信息。

随着研究的深入，元基因组学技术和高通量测序技术逐渐成为微生物研究的主流。Findley等(2011)[15]用 ZAP载体构建了瘤胃原虫元基因组文库。Kittelmann等(2013)[8]用 454高通量测序测定了饲喂不同日粮的奶牛、绵羊和红鹿的瘤胃原虫。lshaq等(2014)[16]利用高通量测序法测定了阿拉斯加地区驼鹿的肠道原虫。

5 营养物质对瘤胃原虫的影响

增加饲粮的精粗比，可以显著增加瘤胃总原虫数量和种属。粗饲料来源不同时，增加饲粮精粗比都会增加原虫数量，当饲粮精料由30%提高到70%时，瘤胃原虫增加29%，内毛属增加1/4。不同饲粮精粗比调节原虫数量可能是通过降低瘤胃pH值来实现的。

在饲粮中添加莫能菌素、单宁和脂类等添加剂对瘤胃原虫数量显著影响。油脂添加到饲粮，瘤胃原虫数量显著降低，表明油脂可以抑制原虫生长，作用机理是原虫对饲粮中脂类的采食、吸收和转运的能力十分有限（王梦芝，2001）[17]。王梦芝等(2011)[17]利用克隆测序、遗传指纹图谱和显微镜计数等方法研究发现，羽毛粉、玉米蛋白粉、豆粕和鱼粉4种蛋白补充配合日粮对瘤胃内毛属、前毛属和头毛属原虫数量有显著影响。

6 展 望

高爱武（2003）[18]等发现瘤胃原虫的种类、数量、功能受瘤胃内环境包括内容物稀释率和外流速率、饲粮类型、动物种类等影响，同时瘤胃原虫与其他瘤胃微生物之间存在互作、竞争和拮抗等关系，把瘤胃微生物的结构与功能联系起来开展整体研究，有助于认识微生物的本质，有利于反刍动物的生产。

交叉学科的融合发展，如分子生物学技术和动物营养学结合，为瘤胃原虫研究提供了新思路，将其它学科与经典微生物结合，通过挖掘瘤胃原虫对营养素的利用；以及营养素调控瘤胃原虫区系，种类、数量以及发酵类型，从而整体调节调控瘤胃功能，加以开发和利用可能是科研工作者今后的研究重点。

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Research Progress of Rumen Protozoan Colonization

PENG Hong-gang1，CHEN Xiang-yu2，LIU Yan-feng2*,ZHANG Ling2
（1.Kuerchu Horticultural Farm of Korla Xinjiang,Korla 841000，China；2.Xinjiang Academy of Animal Science,Urumqi 830013，China）

A large number of rumen of ruminants protozoa play an important role in the fermentation and decomposition of feed nutrients and heep maintaining the stability of the micro ecological environment.This paper summarizes the establishment of rumen protozoa in the rumen,the sources of nutrients in rumen protozoa,the influence on rumen environment and the application of molecular biotechnology in rumen protozoa.

rumen；protozoa；ciliates；research progress

S852

A

1003－6377（2017）05－0009-05

新疆公益性科研院所基本科研业务经费（KY2017016）；国家公益性行业（农业）科研专项（201303062）

彭宏刚（1982-），男，硕士，兽医师，长期从事畜牧兽医技术推广。E-mail：phg-w@163.com

刘艳丰（1981-），男，副研究员，主要研究方向为反刍动物营养。E-mail：liuyanfeng520@sina.com

2017-06-16，

2017-07-28