不同土壤中紫花苜蓿根瘤菌抗逆性的区别

杨淑君，何永攀，柯梅，李莉，史伟，吴枫，陈翔宇，侯钰荣

（新疆畜牧科学院草业研究所，新疆 乌鲁木齐 830000）

草业科学

不同土壤中紫花苜蓿根瘤菌抗逆性的区别

杨淑君，何永攀，柯梅，李莉，史伟，吴枫，陈翔宇，侯钰荣*

（新疆畜牧科学院草业研究所，新疆 乌鲁木齐 830000）

紫花苜蓿的茎叶柔嫩鲜美，可广泛用于喂养牛羊、加工草粉、配置饲料或混合饲料，适合于各类畜禽，因其广泛的应用性被大量种植。为了可以精确收集紫花苜蓿根瘤菌抗盐性强弱数据，本次实验从新疆盐碱土和棕漠土地区取6个紫花苜蓿根瘤菌菌株样品，然后分别对各个样品进行耐盐性、耐酸碱性及其相应泌酸碱能力强弱的测定。结果表明:棕漠土土壤紫花苜蓿根瘤菌株S-c有着极强的耐盐性，因为该菌株可以在浓度为10%的NaCL培养基上正常生长；盐碱土壤紫花苜蓿根瘤菌株M-a和棕漠土土壤紫花苜蓿根瘤菌株S-b在所有菌株中耐酸性最强，这两个菌株可以在pH为4.0的酸性培养基上正常生长；而有着最强耐碱性的菌株是盐碱土壤菌株M-c，该菌株可以在pH为12.0的碱性培养基上正常生长。经过进一步实验得出：棕漠土土壤紫花苜蓿根菌株S-a不但可以在pH为4.0的酸性培养基中正常生长，还可以在pH为11.0的碱性培养基中正常生长。而根瘤菌菌株的泌酸能力与其抗碱性息息相关。

紫花苜蓿；根瘤菌；耐盐性；耐酸碱性；泌酸能力

10.16863 /j.cnki.1003-6377.2017.05.009

众所周知，豆科植物其根部与其共生的根瘤菌具有固氮作用，该固氮作用一直是生物固氮领域中研究的集中点，豆科植物与根瘤菌以其强大的固氮作用吸引着众多学者竞相研究。近年来，我国逐渐对生物固氮作用加大关注并且固氮作用在国际农业地位也在逐渐上升，根瘤菌肥发展迅速，种类不断增多，但是各类根瘤菌肥的促生效果却有好有坏。导致其促生效果较差的根本原因在于：一是经过层层筛选的根瘤菌的抗逆性较弱，无法适应不同土壤环境，在接种到土壤中后存活率并不高；二是土壤中本来存在的土著根瘤菌已经适应了土壤环境，与接种的根瘤菌相比具有适应优势，而原本土壤中存在的根瘤菌，结瘤固氮能力相对较弱[1]。改变此类情况需要在筛选菌株的时候，综合考虑根瘤菌寄主植物的生长环境与寄主植物本身形成的寄托关系，筛选既可以在寄主植物中良好生存又可以适应环境条件的特异菌株，或者是筛选可以适应多种寄主植物以及复杂环境条件的广谱菌株。

一般经过筛选的菌株都会具有如下特点：高效的固氮能力[2]；可与寄主植物快速形成根瘤；适应田间对应的环境条件，可以快速结具有高效固氮能力的瘤；具备较强的竞争能力，可以与土壤中原本存在的根瘤菌竞争结瘤，即使没有及时找到寄主植物也可以较长时间的存活；可以在寄主植物生存的基质中存活；可以很好地耐受酸碱、化肥以及农药的侵蚀；可以稳定的遗传，提高固氮能力。所以，对寄主植物的根瘤菌进行层层筛选，提高根瘤菌的固氮作用及效率，对于紫花苜蓿等牧草的生产具有非常重要的现实意义。

我国于20世纪50年代开始研究根瘤菌，起步相对于发达国家较晚，而且主要是以国外根瘤菌试剂的应用为主要研究内容，直至20世纪80年代初才开始进行大规模的植物根瘤菌筛选实验与其相关应用的研究。我国地域辽阔，使得根瘤菌菌株不仅具有多样性，还具有抗逆性差异较大的特点，所以筛选出优良的紫花苜蓿根瘤菌，利用其进行菌株试剂的开发，具有非常重要的意义。新疆与国内其他地区的土地条件差异较大，筛选出适合新疆地区土地盐碱性严重、气温差异较大的菌株，实现其强抗逆性、早结瘤、高结瘤率，建立一个既高效又适应的苜蓿-根瘤菌共生固氮体系，开发生产出一系列苜蓿根瘤菌菌株试剂以及菌株肥料产品并进行推广，对于我国畜牧业、农业调整产业结构、进行生态化改革具有十分重大的意义[3]。

本次实验利用基因与环境相互作用的数据处理方法，对在不同土壤条件中生长的紫花苜蓿根系作相应处理，准备6株根瘤菌菌株，对其分别进行耐盐、耐酸、耐碱以及其泌酸能力的实验，对数据进行分析，以达到筛选出具有优良抗逆性的根瘤菌菌株，为新疆等类似的高纬度盐碱地地区建植紫花苜蓿草地提供优良的根瘤菌菌株资源[4]的目的。

1 材料与方法

1.1 菌株采样地及菌株

根瘤菌菌株的采样地位于新疆适合苜蓿大面积种植的玛纳斯县（盐碱地）和石河子郊区（棕漠土土壤），玛纳斯位于新疆昌吉州，土壤的pH为7.6～8.5，而石河子郊区土壤为棕漠土，土壤pH在7.0左右，紫色苜蓿在两个地区均可以良好生长，采样区域分布合理。实验所用根瘤菌菌株具体情况如表1所示。

表1 根瘤菌菌株编号及采样地

1.2 实验所用培养基

实验过程所采用的的基础培养基选用YMA型培养基，培养基配方为:甘露醇10.0 g/L，NaCL 0.1 g/L，MgSO4·7，H2O 0.2 g/L，小苏打粉1.0 g/L，K2HPO40.6 g/L溶解于1 000 mL蒸馏水中，调节pH值维持在6.9～7.1。

1.3 实验设计方法

1.3.1 根瘤菌菌株耐盐性测定方法

分别配制NaCL浓度为C1=0.8%，C2=1.2%，C3=2.4%，C4=3.0%，C5=8.5%,C6=9.0%,C7=10.0%的YMA培养液，并分别进行除菌操作，然后将采集的根瘤菌菌株分别接种至不同盐浓度的YMA基础培养基中，置于摇床中培养，摇床温度设置为25℃，转速调节为150 r/min，在74～86 h后利用分光光度计检测各个培养基中OD600的值，该值可以检测试验中所用的根瘤菌菌株在不同的盐浓度培养基中的生长情况，以空白培养基作为对照，每个培养基试验均设置三个重复试验，以保证数据的可靠性[5]。

1.3.2 根瘤菌菌株耐酸碱性测定

利用稀盐酸与稀NaOH调节YMA培养液pH值，将培养基的pH分别调节为3.0，4.0,5.0,6.0,8.0,9.0, 10.0,11.0以及12.0，将采集的根瘤菌分别接种到不同pH梯度的培养基中，置于摇床中培养，摇床温度设置为25℃，转速调节为150 r/min，在74～86 h后利用分光光度计检测各个培养基中OD600的值，该值可以用于检测试验所用根瘤菌菌株在不同酸碱性的培养基中的生长情况，以空白培养基作为对照，每个培养基试验均设置三个重复试验，以保证数据的可靠性。

1.4.3 根瘤菌菌株泌酸碱性测定

向1 000 mL液体YMA培养基中加人5 mL0.5%溴麝香草酚兰溶液，利用灭菌操作后的NaOH溶液将培养基液体pH调节至7.0，此时培养基颜色为草绿色。取相同浓度的根瘤菌菌株悬浮液1 mL，将其接种到灭菌操作后的溴麝香草酚兰培养基接种在液体培养基中，进行3次重复试验，置于25℃摇床中培养，转速调节为150 r/min，3～6 d后进行变色观察，酸性液体呈现黄色，碱性液体呈现蓝色，后用pH计测试菌液的pH值[6]。

1.5 数据处理

GGE双标图的数学模型可以在对根瘤菌菌株进行基因评价的同时顾及到根瘤菌菌株的总体效应和根瘤菌菌株与环境香菇作用效应的试验方法。该模型可以将苜蓿品种区域的有关实验数据标准化，然后经过对主成分PC1和PC2的数值进行单一分解，将主成分在PC1和PC2上的特征向量绘制为GGE双标图。而GGE双标图所采用的环境平均坐标法可以使其更全面、更生动的显示出数据表中的信息，从而得到详细结果。即GGE双标图可以利用环境坐标确定所需理想菌株的位置，虽然并不一定会真实存在理想菌株，但是可以根据根瘤菌菌株接近理想菌株位置的情况直观的对实验菌株进行筛选，即越是靠近同心圆中心，该菌株就越是接近理想菌株，反之亦然。而在本次实验过程中，与评价根瘤菌菌株相关的只有菌株生长效应及菌株与环境作用效应。

1.6 实验数据处理方法

实验过程中主要采用Excel 2003统计软件统计相关数据以及利用基因一—基因环境互作分析软件(GGEbiplot 5.2)处理相关数据。GGE双标图的数学模型可以在对根瘤菌菌株进行基因评价的同时还可以顾及到根瘤菌菌株的总体效应以及根瘤菌菌株与环境相互作用效应的试验方法。该模型可以将苜蓿品种区域的有关实验数据标准化，然后经过对主成分PC1和PC2的数值进行单一分解，将主成分在PC1和PC2上的特征向量绘制为GGE双标图。而GGE双标图所采用的环境平均坐标法可以使其更全面、更生动的显示出数据表中的信息，从而得到详细结果。即GGE双标图可以利用环境坐标确定所需理想菌株的位置，虽然理想菌株并不一定会真实存在，但是可以根据根瘤菌菌株距离理想菌株位置直观的对实验菌株进行筛选，即越是靠近同心圆中心，该菌株就越是接近理想菌株，反之亦然。而在本次实验过程中，与评价根瘤菌菌株相关的只有菌株生长效应及菌株与环境作用效应。

2 结果与分析

2.1 紫花苜蓿根瘤菌株耐盐性

在不同NaCL浓度的YMA培养基中紫花苜蓿根瘤菌菌株的生长情况差异较大，其中Hmx-c菌株可以在10.0%NaCL浓度的YMA培养基上生长良好，表明其具有良好的耐盐性，而Lmx-a、Lmx-c两种类型的紫花苜蓿根瘤菌菌株在2.4%NaCL浓度的YMA培养基上不生长或是生长量极少，表明其不抗盐或抗盐性极差，但是大多数的紫花苜蓿根瘤菌菌株适宜在0.8%至3.0%NaCl浓度下生长。

如图1双标图所示：主成分PC1约占80.7%，而PC2约占16.3%，主要成分中集中了根瘤菌菌株基因、基因与环境绝大多数的变异信息约97%，据此分析推断具有较大的可靠性。实验结果的主要信息就包含在图1中的6个根瘤菌菌株点以及7个不同盐度的培养环境点中。在分析GGE双标图时，AEA表示的是根瘤菌菌株的一般耐盐性，所以线段在AEA的投影箭头指向应该为正向，也就是说，当根瘤菌菌株在AEA轴上投影点越往右则表示其耐盐性就越强；而AEC的纵坐标轴表示菌株的稳定性，在该纵轴的右边，根瘤菌菌株的耐盐性表示值大于平均耐盐性表示值，在其左边根瘤菌菌株的耐盐性表示值则小于平均耐盐性表示值，综上所述，根瘤菌菌株样品的耐盐性顺序为Hmx-c>Hmx-b>Lmx-b>Hmx-a>Lmx-c>Lmx-a。从图1我们可以看出，根瘤菌菌株Hmx-a具有良好的稳定性。而综合比较的话，耐盐性和稳定性都相对较好的根瘤菌菌株为Hmx-c。

由于越是接近理想菌株的根瘤菌菌株越是优良，越是靠近同心圆的中心，根瘤菌菌株就越接近我们所要筛选的菌株，由图1建立同心圆如图2，Hmx-c最接近最小同心圆，表明该菌株使耐盐、稳定的根瘤菌菌株；而Lmx-a和Lmx-c菌株距离最小同心圆较远，表明其耐盐性、稳定性都比较差。

图1 双标图显示菌株耐盐性及稳定性

图2 同心圆与理想菌株

2.2 紫花苜蓿根瘤菌株的耐酸碱性

在酸性YMA培养基中，各个根瘤菌菌株都可以在pH为5.0的培养基中生长，而其中的根瘤菌菌株Lmx-a和Hmx-a在pH为4.0的培养基中生长正常，这两种菌株具有很强的耐酸能力，由酸性双标图（未列出）可得，实验所用根瘤菌菌株的耐酸性顺序为Lmx-a>Hmx-b>Hmx-a>Lmx-b>Lmx-c>Hmx-c，同时Lmx-a也具有很好的稳定性。而在当YMA培养基为碱性环境下时，所有根瘤菌菌株都可以在pH为10.0的碱性培养基中正常生长，而根瘤菌菌株Hmx-c和Hmx-a还可以在pH为11.0碱性更强的培养基上正常生长，其耐碱性顺序为Hmx-c>Hmx-a>Lmx-c>Lmx-b>Lmx-a>Hmx-b。综上所述，Hmx-a不但可以在pH为4.0的酸性培养基上正常生长，而且可以在pH为11.0的碱性培养基上正常生长，并且其稳定性也相对较高。

2.3 紫花苜蓿根瘤菌泌酸能力

所有接种根瘤菌的培养基颜色均变黄，各个培养基最终的黄色随pH降低而逐渐加深，这说明实验所选的六种根瘤菌株均有泌酸能力。因各个根瘤菌菌株的泌酸能力有明显的差异，其中Lmx-a菌株的泌酸能力最强，其培养液的pH值为3.53，Lmx-b菌株的泌酸能力较强，其培养液的pH值为4.11，其余根瘤菌菌株的培养液pH介于4.14至5.18之间。综上所述，根瘤菌菌株Lmx-a在实验采用的所有菌株中泌酸能力是最强的，而且在所有实验菌株中该菌株的耐碱性也是最强的。

3 讨 论

经过实验发现有4种实验菌株可以在10.0%NaCL浓度下得YMA培养基中正常生长，此类情况与康金花等人报道的R346新疆苜蓿菌株可在盐度较高的地区顺利生长情况一致，但是却与其他地区不同种属的植物根瘤菌有很大差异，具体原因需要做进一步的对比实验才能知道[7]。本次实验过程中发现根瘤菌菌株Hmx-a在pH为4.0和11.0的YMA培养基中都可以正常生长，可以初步判断，该种类根瘤菌在长期环境的影响下使其具备了强大的抗逆性，而该种类根瘤菌的抗逆性机理需进一步实验进行研究。同时耐碱性强的根瘤菌菌株同样具备较强的泌酸能力，暗示紫花苜蓿根瘤菌的抗碱性可能与其泌酸能力存在相关关系。

总体来看棕漠土土壤(石河子市郊区地区)紫花苜蓿根瘤菌的耐盐能力最强。而玛纳斯县的紫花苜蓿根瘤菌不但有很好的耐酸碱能力而且具备良好的泌酸能力。根瘤菌菌株Hmx-a可以在pH为4.0的YMA培养基中正常生长，还可以在pH为11.0的YMA培养基中正常生长，综合相关试验数据后发现：根瘤菌菌株Lmx-a具有良好的抗逆性能力。

[1]朱瑞芬，唐凤兰，刘杰淋，等.不同土壤中紫花苜蓿根瘤菌抗逆性的比较[J].草地学报,2013,(06): 1113-1118.

[2]师尚礼.苜蓿根瘤菌固氮研究进展及浅评[J].中国草地,2005,(05):63-68.

[3]康金花，关桂兰，沈艳芳.苜蓿根瘤菌耐盐碱性试验[J].干旱区研究，1996，（03）：74-77.

[4]杨健.不同紫花苜蓿品种与根瘤菌优化共生匹配组合的筛选[D].长春：吉林农业大学,2016.

[5]陈利云.盐渍地紫花苜蓿根瘤菌研究[D].兰州：兰州大学,2009.

[6]张琴，张磊，魏世清，等.钙离子对紫花苜蓿及苜蓿根瘤菌耐酸能力的影响[J].应用生态学报,2007,(06): 1231-1236.

[7]曾昭海.紫花苜蓿高效根瘤菌筛选及田间鉴定方法研究[D].北京：中国农业大学,2003.

Difference in Stress Resistance of Alfalfa Rhizobia in Different Soils

YANG Shun-jun，HE Yong-pan，KE Mei，LI Li，SHI Wei，WU Fan，CHEN Xiang-yu，HE Yu-rong*
（Grassland Institute，Xinjiang Academy of Animal Science,Urumqi 830000，China）

In order to accurately collect salt stress resistance data of Alfalfa rhizobium,6 alfalfa Rhizobium strains were collected from saline alkali soil and brown desert land in Xinjiang,and detect the salt tolerance, acid and alkaline resistance and their corresponding secretion acids and alkaline.The result show that,the Rhizobium S-c strains from Brown desert soil have a strong salt tolerance because the strain can grow normally at a concentration of 10%NaCL;the Rhizobium M-a strains collected from saline alkali soil and Rhizobium S-b strains exhibited the highest acid tolerance among all strains,and this two strains could grow normally in the acidic medium of pH 4.0;The strain with the strongest alkali resistance is M-c strain from the saline soil,which can grow normally on an alkaline medium of pH 12.0 In addition,S-a strain from Brown desert soil can not only grow in the acidic medium of pH 4.0,but also grow in alkaline medium of pH 11.0, and the acid producing ability of Rhizobium strains is closely related to their alkaline resistance.

S812.29

A

1003－6377（2017）05－0047-05

自治区公益性基本科研业务费项目（KY201714）

杨淑君（1983-），女，硕士研究生，主要从事草地微生物方面的研究。E-mail:yanger0910@126.com

侯钰荣（1982-），女，副研究员，主要从事草地生态研究工作。E-mail:houyurong0994@126.com

2017-08-09，

2017-08-15

Key worlds:Alfalfa;rhizobia;salt stress resistance;acids and alkaline stress resistance;acid secretion ability