酶法制备萨拉米风味基料的研究

卜冬冬，汪建明，周红，李秉业，张伟伟

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2.山东新泰市检验检测中心，山东泰安 271000；3.山东天博食品配料有限公司，山东济宁 272000）

酶法制备萨拉米风味基料的研究

卜冬冬1，汪建明1，周红2，李秉业3，张伟伟3

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2.山东新泰市检验检测中心，山东泰安 271000；3.山东天博食品配料有限公司，山东济宁 272000）

以发酵肉为原料，研究了酶法水解发酵肉制备萨拉米风味基料的工艺条件。通过单因素试验、正交试验和模糊数学感官评价法最终确定最佳的萨拉米风味的产生条件，分别为蛋白酶添加量1.4%，料水比1∶3，54℃水解3h，水解度达到24.1%，得到的产物经美拉德反应增香具有浓郁的萨拉米风味。

酶法水解；正交试验；萨拉米风味；发酵肉

肉味香精是近年来迅速发展起来的食用香精之一，早期的肉类香精主要是利用各种单体香料和其他辅助配料经拌和、调香制备而成，这种方法制备的香精往往特征香气不足、口感较差。以氨基酸、水解动植物蛋白（HAP，HVP）和还原糖为主要原料制备热反应香精的技术逐渐被肉味香精生产企业所采用，用此种方法生产的肉味香精产品香味浓郁、成本较低，但由于其原料为非肉源，所以缺少肉类的特征风味和天然香气。

为了进一步改善肉味香精的质量，酶解法技术应运而生，酶解工艺具有条件温和，副反应少，有利于营养成分的保留，生产工艺易控制等优点。本文以发酵肉为主要原料，利用酶解技术制备萨拉米风味基料，为后期成品香精的制备奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要原料与试剂

新鲜猪肉市售；复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、风味蛋白酶山东天博食品配料有限公司提供。

氯化钠、甲醛、硫酸、盐酸、硼酸（均为分析纯） 山东天博食品配料有限公司提供。

1.2 主要仪器设备

98-1-B电子调温电热套，天津市泰斯特仪器有限公司；PHS-3C数显pH计，上海精密科学仪器有限公司；MS403S分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；KT840凯氏定氮仪，丹麦福斯有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 制作工艺

猪肉糜→发酵→发酵肉→酶解→灭酶→成品。

1.3.2 氨基态氮的测定

采用甲醛滴定法［1］。

1.3.3 总氮的测定

采用凯式定氮法［2］。

1.3.4 水解度的测定［3］

1.3.5 单酶的筛选

准确称取发酵肉30g，选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶8种蛋白酶分别酶解发酵肉，蛋白酶添加量均0.6%，pH自然，酶解温度为各蛋白酶的最适温度，酶解时间2h，通过测定酶解液的水解度来选择效果最佳的蛋白酶。

1.3.6 蛋白酶的复配

将风味蛋白酶分别与步骤1.3.5中水解度较高的3种蛋白酶以1∶1进行复配，蛋白酶添加量0.6%，pH自然，酶解温度55℃，酶解时间2h，通过测定酶解液的水解度来选择效果最佳的蛋白酶组合。

1.3.7 酶解工艺的优化

1.3.7.1 酶解温度对酶解工艺的影响

准确称取发酵肉30g，酶解温度分别为30，40，50，60，70℃，蛋白酶添加量0.6%，酶配比（胰蛋白酶∶风味蛋白酶）1∶1，料水比1∶1，酶解时间2h，通过测定酶解液的水解度来选择效果最佳的酶解温度。

1.3.7.2 酶解时间对酶解工艺的影响

在前期试验的基础上，酶解时间分别为1，2，3，4，5，6h，通过测定酶解液的水解度来选择效果最佳的酶解时间。

1.3.7.3 料水比对酶解工艺的影响

在前期试验的基础上，料水比分别为1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2，1∶2.5，1∶3，通过测定酶解液的水解度来选择效果最佳的料水比。

1.3.7.4 蛋白酶添加量对酶解工艺的影响

在前期试验的基础上，蛋白酶∶添加量分别为0.6%，0.8%，1%，1.2%，1.4%，1.6%，通过测定酶解液的水解度来选择效果最佳的蛋白酶添加量。

1.3.7.5 蛋白酶配比对酶解工艺的影响

在前期实验的基础上，酶配比（胰蛋白酶∶风味蛋白酶）分别为1∶1，1.5∶1，2∶1，通过测定酶解液的水解度来选择效果最佳的蛋白酶配比。

1.3.8 酶解工艺的正交优化试验

根据单因素试验结果，选择对酶解工艺影响较大的四个因素即酶解温度、酶解时间、加酶量、料水比及空列，采用五因素四水平的正交试验对酶解工艺进行优化，正交试验设计见表1。

表1 正交试验设计表Table 1Orthogonal test design table

2 结果与讨论

2.1 单酶的筛选

不同蛋白酶酶解同一种物质，会使得水解程度和水解产物组成不同［4］，故实验选取多种性质各异的蛋白酶对发酵肉进行酶解。按照1.3.5进行试验，单一蛋白酶的酶解效果见图1。

图1 单酶对酶解工艺的影响Fig.1Influence of single enzyme on enzymolysis technology

由图1可知，8种蛋白酶对发酵肉的酶解效果差异较明显，胰蛋白酶的酶解效果最佳，水解度11.0%；木瓜蛋白酶的酶解效果次之，水解度9.7%；复合蛋白酶的酶解效果仅次于木瓜蛋白酶，水解度8.9%。故胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和复合蛋白酶是单酶酶解发酵肉中效果最好的3种蛋白酶。

2.2 蛋白酶的复配

酶解过程中，蛋白酶具有特异的酶切位点，酶解作用范围较小，因此选择复配酶解，可以使得疏水氨基酸被进一步水解。由于风味酶同时具有内切和外切两种活性，可用于脱除水解液的苦味，改善水解风味［5，6］。故采用风味蛋白酶分别与胰蛋白酶、木瓜蛋白酶及复合蛋白酶复合酶解发酵肉，在一定程度上提高酶解液的风味、减少苦味。按照1.3.6进行试验，双酶的酶解效果见图2。

图2 双酶对酶解工艺的影响Fig.2Influence of double enzymes on enzymolysis technology

由图2可知，双酶酶解发酵肉酶解效果的优劣顺序为风味蛋白酶＋胰蛋白酶＞风味蛋白酶＋木瓜蛋白酶＞风味蛋白酶＋复合蛋白酶。故风味蛋白酶与胰蛋白酶复合酶解发酵肉的酶解效果最佳，水解度为12.9%。

2.3 酶解条件的优化

2.3.1 酶解温度对酶解工艺的影响

按照1.3.7.1进行试验，研究酶解温度对酶解工艺的影响，结果见图3。

图3 酶解温度对酶解工艺的影响Fig.3Influence of enzymolysis temperature on enzymolysis technology

蛋白酶的活性受温度影响较明显，由图3可知，在一定温度范围内，随着酶解温度的不断增加，水解度呈现先升高后降低的趋势。因为反应温度太低，酶活力不足，水解较慢，反应不完全；当温度较高时，部分酶失活，水解不完全。酶解温度50℃时，水解度达到最高，为18.7%，故酶解温度50℃时，酶解效果最佳。

2.3.2 酶解时间对酶解工艺的影响

按照1.3.7.2进行试验，研究酶解时间对酶解工艺的影响，结果见图4。

图4 酶解时间对酶解工艺的影响Fig.4Influence of enzymolysis time on enzymolysis technology

由图4可知，酶解时间从1h增加到3h时，水解度增加速度较快；酶解时间从3h增加到6h的过程中，水解度增加缓慢，最终趋于平稳。酶解时间从2h增加到3h时，水解度提高了24.8%；酶解时间从3h增加到4h时，水解度仅提高了4.22%，从经济效益考虑，应选择酶解时间为3h，此时的水解度为16.6%。

2.3.3 料水比对酶解工艺的影响

按照1.3.7.3进行试验，研究料水比对酶解工艺的影响，结果见图5。

图5 料水比对酶解工艺的影响Fig.5Influence of material-water ratio on enzymolysis technology

酶的水解过程是一个可逆过程，料水比直接影响水解氨基酸及多肽的浓度，从而可能影响底物的最终水解度。由图5可知，随着料水比比值的降低，水解度呈现先增加后减小的趋势，在料水比1∶2.5时，水解度最大，为18.2%，故料水比1∶2.5时，酶解效果最好。

2.3.4 蛋白酶添加量对酶解工艺的影响

按照1.3.7.4进行试验，研究蛋白酶添加量对酶解工艺的影响，结果见图6。

图6 蛋白酶添加量对酶解工艺的影响Fig.6Influence of enzyme addtive amount on enzymolysis technology

由图6可知，随着蛋白酶添加量的增加，水解度呈现出整体上升最后趋于平缓的趋势，蛋白酶添加量低于1.2%时，随着蛋白酶添加量的增加，水解度不断增加，且增加速度较快，此时，底物尚未被酶饱和，通过添加酶量可以结合更多的底物，在多个酶切位点进行反应［7］；蛋白酶添加量高于1.2%时，水解度略有增加最终趋于平缓，说明底物接近饱和状态，酶添加量的增加很难提高酶切效率，从节约成本的角度出发，选择最佳蛋白酶添加量为1.2%，此时水解度为20.1%。

2.3.5 蛋白酶配比对酶解工艺的影响

按照1.3.7.5进行试验，研究蛋白酶配比对酶解工艺的影响，结果见图7。

图7 酶配比对酶解工艺的影响Fig.7Influence of enzyme ratio on enzymolysis technology

由图7可知，胰蛋白酶∶风味蛋白酶为1.5∶1时，水解度最高，达到20.6%，水解效果最佳，故1.5∶1为最优酶配比。

2.4 酶解工艺的正交优化试验

根据单因素试验结果，采用五因素四水平的正交试验对酶解工艺进行了优化，正交试验设计见表1，得到的正交试验结果见表2，根据正交试验结果得到的正交试验效应曲线图见图8。

表2 正交试验结果表Table 2Result table of orthogonal test

图8 正交试验效应曲线图Fig.8Effective curves of orthogonal experiment

极差R的大小可以用来衡量实验中相应因素作用的大小，各因素的极差与空列的极差相比较，比空列极差大说明该因素对酶解效果影响显著，反之说明该因素对酶解效果影响不显著；极差R值越大，说明显著性越高，反之说明显著性越低。

由表2可知，对正交试验结果进行极差分析可得极差的大小顺序为RC＞RB＞RD＞RE＞RA，可见酶解时间、加酶量及料水比的极差均大于空列，故酶解时间、加酶量及料水比均对酶解工艺影响显著；而酶解温度的极差小于空列，故酶解温度对酶解工艺的影响不显著。显著因素从主到次的顺序为C（加酶量）＞B（酶解时间）＞D（料水比）。

由图8可知，最优方案为A3B4C4D4，即酶解温度54℃，酶解时间3.5h，蛋白酶添加量1.4%，料水比1∶3，考虑到KB3＝0.206，KB2＝0.207，两者相差极小，为节约成本，A3B3C4D4被考虑在最优方案之列。进行试验验证，重复3次，方案A3B4C4D4的水解度24.9%，方案A3B3C4D4的水解度24.1%，综合考虑，选择A3B3C4D4为最优方案，即酶解温度54℃，酶解时间3h，蛋白酶添加量1.4%，料水比1∶3。

2.5 模糊数学评价检验

水解度高说明酶解效果好，即被蛋白酶酶解后产生的氨基酸及肽含量高，为后期美拉德反应提供高效反应原料。水解度不同说明酶解液中氨基酸及肽的含量不同，后期美拉德反应产生的风味就会有所差异［8］。对正交试验最优方案A3B4C4D4（第1组）和方案A3B3C4D4（第2组）进行轻度美拉德增香反应，采用模糊数学评价检验法选出最具萨拉米风味的基料，不但克服了感官评定的主观性和片面性，使模糊的问题数学化，还可使评定结果更趋于合理性［9］。

2.5.1 模糊矩阵建立结果

对正交试验最优方案A3B4C4D4（第1组）和方案A3B3C4D4（第2组）进行模糊数学评价检验，最终确定酶解工艺的最佳条件。则评判对象集 U为：U＝｛u1……ui，……un｝，对于萨拉米风味基料，确定由3项指标组成因素集，即U＝（气味u1，滋味u2，整体协调性u3）；评判因素V＝（vl，v2，……，vi，……，vm），经过评定小组讨论，确立萨拉米风味基料的评语集为V＝（优秀v1，良好v2，一般v3，较差v4），各级评语对应的感官评定标准见表3。

表3 萨拉米风味基料的感官评定标准表Table 3Sensory evaluation standard table of Salami flavor base

根据参考文献［10］确定其相应的权重向量为：W＝｛w1，……wi，……wn｝＝（0.36，0.34，0.30）。

将每个样品的质量评价因素进行归一化处理，得到以下模糊矩阵：

其中j＝l，2为样品编号，i＝l，2，3为质量评价因素，ril，ri2，ri3分别为第i个评价因素。

10名感官评定员对2组样品按气味、滋味、整体协调性3个因素逐一评价，其对应的等级票数分布情况见表4。

表4 感官评定票数分布Table 4Votes＇distribution of sensory evaluation

根据以上规定，得到2组样品的模糊矩阵：R11＝V11/10……。

2.5.2 模糊变换及综合评价结果

根据模糊矩阵变化原理：R＝W×A，则第1组样品的综合评价结果为：R1＝W×A1＝（0.36，0.34，0.30）×A1＝（0.466，0.344，0.166，0.034）；第2组样品的综合评价结果为：R2＝W×A2＝（0.36，0.34，0.30）×A2＝（0.6，0.236，0.134，0.03）。

以上结果说明，第1组样品有46.6%的感官评定员认为其等级为优秀，34.4%的感官评定员认为其等级为良好，16.6%认为一般，3.4%认为较差。第2组样品具有最高的隶属优秀频率，其综合感官为优秀的概率为60%，远远超过第1组样品，且只有3%的评定员认为其较差，第2组样品隶属良好的频率较第1组低，但优秀与良好的总隶属率达到83.6%，是2组样品中最高的。根据最大隶属原则认为样品2的综合感官最佳，即酶解温度54℃、酶解时间3h、蛋白酶添加量1.4%、料水比1∶3。

3 结论

以发酵肉为原料，通过蛋白酶的筛选、复配确定最佳的蛋白酶组合，即风味蛋白酶和胰蛋白酶；通过单因素试验和正交试验确定最优酶解工艺，即酶解温度54℃、酶解时间3.5h、蛋白酶添加量1.4%、料水比1∶3；最终通过模糊数学感官评价法确定最优的酶解工艺，即酶解温度54℃、酶解时间3h、蛋白酶添加量1.4%、料水比1∶3、水解度24.1%，为后期制备萨拉米风味香精奠定了基础。

［1］GB/T 5009.39－2003，酱油卫生标准的分析方法［S］.

［2］GB 5009.5－2010，食品中蛋白质的测定［S］.

［3］Adler-Nissen J.Determination of the degree of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，1979，27（6）：1256-1262.

［4］Ney K H.Voraussage der bitterkeit von peptiden aus deren aminosurezu-sammensetzung［J］.Lebensm-Umtersueh.Forscha.1971，147（2）：64-71.

［5］Jens Adler-Nissen.Control of proteolytic reaction and of the level of bitterness in protein hydrolysis process［J］.Chem Tech Biotechnol，2008，34（3）：215-222.

［6］Gleann Roy.The use of exopeptidases in bitter taste modification［M］.Asaymposium Pennsylvania：Technomic Publishing Company Inc.，1997.

［7］汪晓，李俊霞，王斐，等.酶法水解羊肉制备肉味香精的研究［J］.食品科技，2008（10）：39.

［8］郇兴建.利用猪骨制备天然肉味香精的研究［D］.南京：南京农业大学，2012.

［9］曹冬梅，王淑娟，王静.模糊数学在豆浆感官评定中的应用［J］.沈阳农业大学学报，2004，35（1）：39-41.

［10］Saiyavit Varavini.Production of meat-like flavor［J］.Science Asia，2000，26：219-224.

Study on Enzymatic Preparation of Salami Flavor Base

BU Dong-dong1，WANG Jian-ming1，ZHOU Hong2，LI Bing－ye3，ZHANG Wei-wei3
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science ＆Technology，Tianjin 300457，China；2.Shandong Xintai Inspection and Testing Center，Taian 271000，China；3.Shandong Tianbo Food Ingredients Co.，Ltd.，Ji＇ning 272000，China）

Study the preparation of Salami flavor base material with enzyme-hydrolyzed fermented meat as raw material.Through single-factor experiment，orthogonal experiment and sensory evaluation method of fuzzy mathematics，the optimum condition for preparation of Salami flavor is defined.The result shows that protease additive amount is 1.4%，material and water ratio is 1∶3，hydrolyzing for 3hunder 54℃.Under such conditions，the degree of hydrolysis reaches 24.1%.The product with better Salami flavor is obtained by Maillard reaction.

enzymatic hydrolysis；orthogonal experiment；Salami flavor；fermented meat

TS202.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.020

1000-9973（2017）03-0085-06

2016－09－04

卜冬冬（1989－），女，硕士，研究方向：食品添加剂。