被动吸烟对大鼠血清和肺组织中白细胞介素17表达的影响

梁会朋 韩书芝 平 芬

(河北省人民医院呼吸内科，河北 石家庄 050051)

被动吸烟对大鼠血清和肺组织中白细胞介素17表达的影响

梁会朋1韩书芝 平 芬

(河北省人民医院呼吸内科，河北 石家庄 050051)

目的 观察被动吸烟和戒烟对大鼠被动吸烟模型血清和肺组织中白细胞介素(IL)-17变化的影响。方法 选择健康雄性Wistar大鼠50只，随机分为5组，分别为正常对照组、被动吸烟4 w、8 w、12 w组和戒烟组。HE染色观察肺组织的病理改变，采用ELISA方法检测血清中IL-17含量，免疫组织化学染色方法观察肺组织中IL-17的表达。结果 被动吸烟可导致肺组织炎症反应和肺气肿改变；被动吸烟组和戒烟组大鼠血清IL-17含量较正常对照组升高，肺组织中 IL-17表达增强；随着被动吸烟时间的延长，血清中IL-17含量逐渐增加，肺组织中IL-17表达逐渐增加；戒烟组较被动吸烟12 w组血清IL-17含量降低，肺组织中IL-17表达减少。结论 被动吸烟可引起肺部炎症，导致血清及肺组织IL-17表达增加，IL-17可能参与了吸烟相关性肺损伤的发生。

被动吸烟；戒烟；肺损伤；白细胞介素17

香烟燃烧产生的烟雾是由气体和悬浮颗粒组成的气溶胶，包含大量氧化剂和多种有毒物质，如尼古丁、焦油、苯并芘等，这些有毒物质进入气道，引起呼吸道黏膜损伤，导致机体炎症反应增强。白细胞介素(IL)-17是近年来人们发现的一种新的细胞因子，主要由Th17细胞产生，是一种促炎性细胞因子，也是炎症反应的早期启动子，因其在诱导炎症方面具有强大的作用而备受重视。本研究通过建立被动吸烟大鼠模型，检测其血清和肺组织IL-17的表达，探讨IL-17在被动吸烟导致肺损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康雄性Wistar大鼠50只，体重150 g左右，由河北医科大学实验动物中心提供，实验过程中动物饲养及取材均遵守实验动物管理和保护的有关规定。将动物随机分为5组：正常对照组、被动吸烟4 w、8 w、12 w组和戒烟组(戒烟组即被动吸烟8 w后戒烟8 w组)，每组10只。实验前适应性喂养1 w。将各被动吸烟组大鼠置于自制70 cm×60 cm×40 cm熏烟箱〔1〕内，每次燃烧15支香烟(钻石牌香烟，焦油量：11 mg，烟气烟碱量1.0 mg)，持续1 h；每天2次，2次间隔时间>6 h，每周7 d。戒烟组大鼠接受被动吸烟8 w后开始戒烟，同正常对照组置于无烟环境中饲养。

1.2 实验方法

1.2.1 HE染色 各实验组大鼠分别在规定的日期，禁食12 h，采用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，留取右肺下叶组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片(片厚约3～4 μm)，用于HE染色，观察肺组织病理变化。

1.2.2 IL-17免疫组织化学染色 每只大鼠肺组织标本取一张切片，用于IL-17免疫组织化学染色(IL-17抗体购于美国Santa Cruz公司，过氧化物酶标记链霉卵白素染色二抗试剂盒及DAB显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2.3 血清IL-17测定 取大鼠腹主动脉血4～8 ml，静置1 h，离心取上清，用于IL-17 ELISA检测(试剂盒购于BlueGene公司)，具体操作步骤严格按照试剂盒说明进行。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行t检验及方差分析。

2 结 果

2.1 肺组织病理改变 正常对照组大鼠气道和肺组织结构完整，无明显病理改变。各被动吸烟组和戒烟组大鼠肺组织出现不同程度的损伤，随着被动吸烟持续时间的增加，肺损伤的程度逐渐加重。被动吸烟4 w组可见到气道黏膜上皮细胞出现坏死、脱落；气道壁和肺组织可见炎性细胞浸润，主要为中性粒细胞和巨噬细胞。被动吸烟8 w组除了上述改变外，气道黏膜上皮细胞受损程度加重，杯状细胞增生，黏液分泌增多，气道平滑肌增生肥大，肺泡壁扩张、变薄，充气增多。被动吸烟12 w组可见肺泡壁进一步变薄，部分断裂融合，呈现显著肺大泡、肺气肿改变；肺组织可见炎性细胞浸润明显，以淋巴细胞和巨噬细胞为主。戒烟组仍可观察到炎症细胞浸润及肺气肿表现，但与被动吸烟12 w组比较，损伤减轻。见图1。

2.2 肺组织IL-17的表达 免疫组织化学染色显示，正常对照组大鼠气道上皮细胞可见有少量IL-17表达；各被动吸烟组大鼠气道上皮细胞IL-17表达增强，在肺泡上皮细胞也可见IL-17表达，且随着被动吸烟持续时间的增加，气道上皮细胞及肺泡上皮细胞IL-17表达逐渐增强，颜色加深；被动吸烟12 w组表达最明显，呈棕褐色，几乎充满整个上皮细胞。戒烟组大鼠气道上皮细胞及肺泡上皮细胞仍可见IL-17明显表达，但较被动吸烟12 w组表达减弱。见图2。

2.3 血清IL-17含量 正常对照组大鼠血清中IL-17含量〔(98.99±12.26)pg/ml〕与被动吸烟组大鼠血清IL-17含量比较显著升高(P<0.01)。随着被动吸烟时间的延长(4 w、8 w、12 w)，血清中IL-17含量逐渐升高〔(118.29±15.71)、(148.99±17.01)、(175.70±15.40)pg/ml，P<0.01〕。戒烟组血清中IL-17含量〔(151.31±20.61)pg/ml〕较正常对照组升高(P<0.01)。戒烟组与被动吸烟8 w组比较IL-17含量轻度增加(P>0.05)。戒烟组与被动吸烟12 w组比较，血清中IL-17含量下降(P<0.05)。

图1 肺组织病理改变(HE，×100)

图2 肺组织IL-17免疫组化表达(DAB，×200)

3 讨 论

香烟烟雾中含有数千种化学物质，如尼古丁、焦油、一氧化碳、自由基、镉、汞、铅、砷以及甲醛、苯并芘等，大部分有毒物质随香烟烟雾被吸入肺部，对肺组织造成严重危害。研究证实被动吸烟使支气管炎、慢性支气管炎、呼吸困难发生的危险性增高；被动吸烟还能够引起肺功能下降，且具有剂量依赖性〔2〕。给予多次被动吸烟后小鼠体内细胞因子如巨噬细胞趋化因子(MCP-1)、粒单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-8水平明显升高。GM-CSF、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β随吸烟时间延长和吸烟剂量增加呈现上升趋势，与吸烟具有量效关系〔3〕，提示炎症反应参与了吸烟导致的肺脏损伤。IL-17是新发现的一种细胞因子，主要由Th17细胞产生。IL-17与其受体结合，主要通过NF-κB-DNA途径和有丝分裂原激活激酶(MAPK)途径发挥其生物学作用〔4〕。IL-17能诱导IL-8、 IL-6 、TNF-α等多种细胞因子和炎性介质的产生，导致机体产生强烈的炎症反应。而IL-8、IL-6 、TNF-α在吸烟导致肺损伤的发病机制中具有重要作用〔5〕。 IL-17还可通过促进C-X-C趋化因子诱导中性粒细胞活化和募集，促进气道炎症反应，参与肺损伤〔6，7〕。本实验提示IL-17可能参与了被动吸烟导致肺损伤的发病机制。

有研究显示吸烟COPD患者的IL-17 mRNA的表达明显高于吸烟肺功能正常者和非吸烟者，IL-17 mRNA与一秒率FEV1%呈负相关〔8〕。对吸烟小鼠注射IL-17抗体发现：抗体处理组小鼠肺泡灌洗液中总细胞计数较吸烟组降低，中性粒细胞比例较单纯吸烟组明显下降，气道炎症减轻。肺组织中的IL-17水平较单纯吸烟组显著降低〔9，10〕，说明IL-17抗体与IL-17结合后降低了IL-17导致的气道和肺脏的炎性反应，减轻了肺损伤程度。

有研究显示吸烟的COPD患者戒烟后12 h血中一氧化碳(CO)的含量就会恢复正常，2 w至3个月肺功能得到改善，1～9个月咳嗽及呼吸短促的发生减少、气道纤毛恢复正常功能〔11〕。Godtfredsen等〔12〕认为戒烟可以减轻呼吸道症状，减轻肺部炎症，延缓肺功能下降速度。本研究进一步证实IL-17参与了被动吸烟导致的肺损伤。实验发现戒烟后炎症反应仍在持续，但较持续被动吸烟组炎症反应程度降低，说明戒烟能缓解烟草烟雾引起的炎症反应。吴卓等〔13,14〕分别对不同吸烟时间造成的肺部炎症、肺气肿、COPD大鼠模型进行观察发现：无论是在早期肺部炎症阶段开始戒烟，还是在肺气肿、COPD形成后开始戒烟，戒烟早期肺部的炎症较正常不吸烟组明显升高，与戒烟前比较，炎症反应仍可见加重；但随着戒烟时间的延长，可见到肺部的炎症反应指标的降低和肺功能改善，与本实验结果相似。

综上，吸烟可导致肺损伤，戒烟虽不能使肺损伤逆转，但可延缓肺损伤进一步发展的速度。吸烟导致肺损伤的机制十分复杂，有待继续深入研究。

1 降文兰,王 玮,曹占良,等.被动吸烟对小鼠白介素-6、白介素-8水平表达的影响〔J〕.职业与健康,2009;25(7):704-5.

2 甘德坤,焦 力,朴文花,等.环境香烟烟雾对非吸烟人群健康影响研究进展〔J〕.环境与健康杂志,2000;17(2):125-8.

3 Melgert BN,Timens W,Kerstjensw HA,etal.Effects of 4 months of smoking in mice with ovalbumin-induced airway inflammation〔J〕.Clin Exp Aller,2007;37(12):1798-808.

4 Langrish CL,Chen Y,Blumenschein WM,etal.IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation〔J〕.J Exp Med,2005;201(2):233-40.

5 Culpitt SV,Rogers DF，Shah P,etal.Impaired inhibition by dexamethasone of cytokine release by alveolar macrophages from patients with chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Am J Respir Crit Care Med,2003;167(1):24-31.

6 Miyamoto M,Prause O,Sjostrand M,etal.Endogenous IL-17 as a mediator of neutrophil recruitment caused by endotoxin exposure in mouse airways〔J〕.J Immunol，2003;170(9):4665-72.

7 Yamada H,Nakashima Y,Okazaki K,etal.Th1 but not Th17 cells predominate in the joints of patients with rheumatoid arthritis〔J〕.Ann Rheum Dis,2008;67(9):1299-304.

8 Zhang J,Chu S,Zhong X，etal.Increased expression of CD4+IL-17+cells in the lung tissue of patients with stable chronic obstructive pulmonary disease(COPD)and smokers〔J〕.Int Immunopharmacol,2013;15(1):58-66.

9 Shen N,Wang J,Zhao M,etal.Anti-interleukin-17 antibodies attenuate airway inflammation in tobacco-smoke-exposed mice〔J〕.Inhal Toxicol,2011;23(4):212-8.

10 陈 辉,屈晓娜,吴世满.豚鼠肺气肿模型肺组织Foxp3、RORγt及IL-17的表达及意义〔J〕.中国呼吸与危重监护杂志,2012;3:223-6.

11 Lerman C.Helping smokers quit through pharmacogenetics〔J〕.LDI Issue Brief,2006;11(6):1-4.

12 Godtfredsen NS,Lam TH，Hansel TT,etal.COPD-related morbidity and mortality after smoking cessation:status of the evidence〔J〕.Eur Respir J,2008;32(4):844-53.

13 吴 卓,姜洪芳,田大力,等.戒烟对慢性阻塞性肺病模型大鼠肺组织病理及肺功能的影响〔J〕.中国老年学杂志,2011;31(4):646-8.

14 姜洪芳,蔡存伟,赵 立.早期戒烟大鼠肺病理及炎性介质变化〔J〕.中国比较医学杂志,2012;22(1):51-3.

〔2015-07-28修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

河北省卫生厅科研基金项目(20130107)

韩书芝(1965-)，女，教授，硕士生导师，主要从事呼吸系统疾病研究。

梁会朋(1985-)，女，硕士，住院医师，主要从事呼吸系统疾病研究。

R563.9

A

1005-9202(2017)04-0834-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.021

1 河北省胸科医院呼吸内科