几丁糖电纺膜完全修复硬膜后与正常硬膜对比研究

郭兴锋朱冬梅陈建民侯春林窦源东

几丁糖电纺膜完全修复硬膜后与正常硬膜对比研究

郭兴锋1朱冬梅1陈建民1侯春林2窦源东2

目的研究几丁糖电纺膜完全修复硬脑膜缺损后，其下方新生纤维膜与正常硬脑膜的差异。方法健康成年的新西兰家兔16只，取头部正中切口在双侧颅顶部对称开直径约1.2cm大小的圆形骨窗；剪去0.8mm×0.8mm大小的硬脑膜组织，并将合适大小的几丁糖膜置入实验侧硬膜缺损区；对照侧不进行硬脑膜切除作对照，缝合皮下及皮肤后进行饲养，术后8周（8周后硬膜已完全重建）处死，观察骨窗周围大体情况，通过组织学检验几丁糖膜下方新生纤维膜与正常硬膜差异。结果①术后见皮肤及皮下无红肿、无渗出、化脓等炎症反应；几丁糖膜被严密包裹；从正中线切开包裹组织，见膜周围无粘连，容易被取出；膜下有新生纤维膜形成，严密封闭脑组织，无脑脊液漏；新生纤维膜与脑组织无粘连；②新生纤维膜组织与正常硬膜对比：HE染色提示实验组术后8周几丁糖膜下新生纤维膜为纤维结缔组织，Masson提示其中大量纤维素及胶原形成，免疫组化提示新生纤维膜已完全成熟，无bFGF表达，未见EGF表达，为完全成熟的纤维结缔组织，与正常硬脑膜无明显差异。结论新型几丁糖膜修补硬脑膜效果确切，且新生纤维膜与正常脑膜无明显差异。

几丁糖电纺膜；硬脑膜；对比研究

几丁糖电纺膜具备修复硬脑膜缺损，防止脑脊液漏的良好功能，具有良好的组织相容性和理想的机械特性，允许自体细胞长入其中，修补材料逐渐代谢并形成有功能的新生组织，在前期实验中已证实。本实验通过动物实验，将几丁糖电纺膜修补缺损的硬脑膜，待完全修复后（笔者取术后8周，确保骨窗周围软组织完全修复），切取几丁糖膜下方新生纤维结缔组织膜，与正常硬脑膜进行对比，从微观角度证实其功能及与正常硬脑膜区别，为临床应用进一步提供证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器

几丁糖电纺膜（本课题组自行研制）；兔Anti-EGFR、Anti-bFGF、辣根过氧化物酶（上海楷洋生物工程有限公司）；BX41显微镜（Olympus公司，日本）；新西兰兔、异戊巴比妥钠粉剂及实验器械耗材等其他物品（由第二军医大学动物实验中心提供）。

1.2 动物模型制备及分组

健康成的新西兰家兔16只，9个月，体重2.3～3.1kg，雌雄不限，用3%戊巴比妥钠按30mg/kg行兔耳缘静脉注射麻醉，将头部固定于动物手术头架上。备皮消毒后，取头部正中切口纵行切开头皮，分离颞肌及颅骨骨膜，用微型磨钻在双侧颅顶部对称开直径约1.2cm大小的圆形骨窗（见图1，彩图见插页），再于手术显微镜下剪去实验侧0.8mm×0.8cm大小的硬膜组织，并将1.0×1.0大小的几丁糖膜置入硬膜缺损区（必要时四角用5-0缝线间断缝合固定，防止移动）。对侧硬膜保留，不做任何处理以作对照，缝合皮下及皮肤后进行饲养，术后8周处死，观察骨窗周围大体情况，仔细分离，取出几丁糖膜，于其下方完整取出新生纤维膜，同时取出对侧正常脑膜，进行HE染色、Masson染色及免疫组化，每组4只家兔。显微镜下观察创面的组织学改变、纤维化程度和内皮细胞生长因子（EGF）、碱性成纤维因子（bFGF）表达情况。

图1 模型制作大体观察：a双侧开对称骨窗，剪去实验侧硬膜组织；保留对照侧硬膜组织；b几丁糖电纺膜置入实验侧硬膜缺损区

1.3 检测指标

1.3.1 观察术后骨窗周围炎症反应、几丁糖膜包裹情况及骨窗与硬膜修复情况等。

1.3.2 新生膜组织与正常硬脑膜对比观察，包括HE染色、Masson染色、免疫组化（EGF与bFGF表达）。

2 结果

术后8周见皮肤及皮下无红肿、无渗出、化脓等炎症反应；几丁糖膜被严密包裹；从正中线切开包裹组织，见几丁糖膜与周围组织无粘连，取出容易；膜内、外表面都被的新生纤维组织覆盖，几丁糖电纺膜外表面新生纤维组织与周围组织结合疏松，形成带血运的新生纤维结缔组织，交界处没有观察到明显的炎症反应和囊壁形成；膜下新生纤维膜严密封闭脑组织外骨窗，无脑脊液漏，切除新生纤维膜见贴近脑组织的内侧面与脑组织无粘连（见图2，彩图见插页）。炎症及排异反应；b膜下有纤维膜样组织形成，无脑脊液漏；c切除纤维膜见膜下脑组织见纤维膜与脑组织无粘连

图2 8周大体观察：a分离皮肤后，见几丁糖膜被严密包裹，无任何

2.1 新生膜组织与正常硬膜对比

术后8周HE染色提示实验组几丁糖电纺膜下方新生纤维膜为纤维结缔组织；Masson提示其中大量纤维素及胶原形成；免疫组化提示新生纤维膜已完全成熟，无bFGF表达，未见EGF表达，为完全成熟的纤维结缔组织，与正常硬脑膜无明显差异（见图3，彩图见插页）。组无明显差异；e实验组bFGF无表达，为成熟的纤维结缔组织；f正常硬脑膜bFGF无表达，与e无差异；g实验组EGFR无表达，为成熟的纤维结缔组织；h正常硬脑膜EGFR无表达，与g无差异

图3 术后8周：a实验组HE染色提示新生纤维组织膜为纤维结缔组织；b正常硬脑膜HE染色与a无明显差异；c实验组Masson染色提示其中大量纤维素及胶原形成，d正常硬脑膜Masson染色与c

3 讨论

硬膜缺损导致脑脊液漏，可引起颅内感染、切口迁延不愈、癫痫发作等严重并发症[1]，所以防止脑脊液漏是一个亟待解决的问题。研究者认为理想的硬膜修补材料必须具有以下特点[2]：①具有一定的弹性、韧性，经得起缝合，能恢复硬膜下腔的完整性；②具有良好的生物相容性；③能为硬膜的自体修复提供支架，以利于成纤维细胞生长，促使硬膜再生，新硬膜形成后，移植物能被逐渐吸收；④不增加术后感染率和颅内血肿发生率；⑤对周围神经组织无损害，不传播疾病；⑥易于消毒储存，经济易得，使用方便。

几丁糖已被证实是一种组织相容性良好的可吸收降解的体内植入生物材料，目前报道的几丁糖膜防粘连膜离最终的实用化还有一定距离，存在的问题主要有：膜与机体粘附性较差；脆性大，手术操作时难以包裹固定，缝合强度明显不足，故单一以几丁糖为原料的几丁糖膜尚未得到临床应用。国外一些学者[3,4]利用几丁糖的优良生物学特性，针对其存在的不足，尝试将几丁糖复合其他材料来改进或者增加其生物学活性，增加了生物膜的强度，但引入第二相带来了其他的缺点，如Zhuang PY等[5]在改性壳聚糖膜生物相容性评价及Hurt等[6]在利用几丁糖复合膜引导组织再生中提出复合膜植入前期出现原因不明的轻度炎症和异物反应，而且复合生物材料成本大幅度增加。

本课题研发的几丁糖电纺膜是由静电纺丝技术制成的单一几丁糖膜，拉升强度大，笔者利用万能力学测试机（AG-5KNx,Shimadzu）对几丁糖电纺膜进行抗拉及撕裂等生物力学性能测定，结果提示几丁糖电纺膜拉伸强度为（7.93±0.35）MPa，远高于文献报道的胶原蛋白、聚己内酯、聚乳酸等纳米纤维膜，强度完全满足硬膜的修补。通过动物实验研究已经证实几丁糖电纺膜组明显优于空白对照组，短期封堵及远期防止脑脊液漏效果明确，允许自体细胞长入其中，几丁糖电纺膜逐渐代谢并形成有功能的新生纤维膜组织，具备重建硬膜的功能[7,8]。

本实验用几丁糖电纺膜完全修复硬脑膜后，切取几丁糖膜下方新生纤维结缔组织膜，与正常硬脑膜进行对照，经过组织学（HE染色，Masson染色）、免疫组化等方法进一步证实了几丁糖电纺膜下方新生纤维组织膜与正常硬脑膜无明显差异。综上述，几丁糖电纺膜达到了理想的硬膜修复材料的标准，但将其应用于临床，还需对其免疫学（生物相容性），体内降解代谢方式，以及对周围脑组、神经组织有无损害等方面进行进一步研究。

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[7]郭兴锋，侯春林，窦源东，等.几丁糖电纺膜预防脑脊液漏即刻效果实验研究[J].生物骨科材料与临床研究，2014，65（4）：1-3.

[8]郭兴锋，侯春林，窦源东，等.几丁糖电纺膜预防脑脊液漏远期效果实验研究[J].中国修复重建外科杂志，2014，28（8）：993-997.

Comparative study of dura mater repaired by chitosan electrospun membrane complely and normal dura mater

Guo Xingfeng1,Zhu Dongmei1,Chen Jianmin1,et al.1Department of Orthopetic Surgery,Bayi Hospital Affiliated Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing Jiangsu,210002;2 Department of Orthopetic Surgery,Changzheng Hospital of the Second Military Medical University,Shanghai,200003,China

Objective To study the difference of normal dura mater and newly grown dura mater after complete repair of dural defects with chitosan electrospun membrane.Methods Round bone windows(diameter=1.2cm)were operated on sixteen healthy adult New Zealand rabbits on bilateral sides symmetrically near the medial line.The dura mater was removed 0.8 mm by 0.8mm,where the chitosan membrane was placed in test group and the dura mater was not removed in controlgroup.Eight weeks(when theduramater was considered reconstructed)after surgery,observation and histology test were run to find the difference between the two groups.Results Postoperative observation showed no swelling,no bleeding,and no fester;and the chitosan membrane was tightly wrapped with no adhesion and leakage.HE staining showed the new grown fiber membrane was mature with no bFGF nor EGF expression.Conclusion Chitosan membrane is effective in repairing dura mater,and the new fiber membrane is histologically close normal meninges.

Chitosan electrospun membrane;Dura mater;Comparative study

R318.08；Q813.1

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2017.01.001

swgk2016-07-00155

郭兴锋（1980-）男，博士，主治医师。研究方向：创伤骨科与修复重建外科，生物材料。

2016-07-04)

1南京中医药大学附属八一医院，江苏南京210002；2第二军医大学附属长征医院，上海200003