类风湿关节炎患者外周血巨噬细胞极化特征分析

孙晓萱 王艳艳 张缪佳 王 嫱

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是临床常见的慢性炎症性疾病[1]。巨噬细胞作为重要的效应靶细胞，是促炎症因子的主要来源之一，可作为炎症因子和调节因子的产生者与RA的发病密切相关[2-3]。

巨噬细胞是一类具有异质性、可塑性的免疫细胞[4]。为了有效的适应微环境，巨噬细胞可通过改变自身表型而形成具有不同形态功能的亚群：经典活化巨噬细胞（Classically activated macrophages，CAM，等同于 M1型巨噬细胞）和替代性活化巨噬细胞（Alternative activated macrophages，AAM，相当于M2型巨噬细胞）。其中M1型巨噬细胞具有促炎症反应特性，可分泌促炎因子如白细胞介素（Interleukelin，IL）-6、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）等；M2型巨噬细胞其特点为产生抗炎症细胞因子，如IL-10，有促进血管生成及组织修复的作用[5-6]。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）及巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）分别是促进单核细胞向M1及M2型巨噬细胞分化的调控因子[7]。巨噬细胞极化与RA发病密切相关，GM-CSF敲除后，胶原诱导关节炎模型鼠（Collageninduced arthritis，CIA）发病率及关节炎评分显著降低[8]。M1型与M2型巨噬细胞是在功能上相互拮抗的细胞亚群，二者在特定的细胞因子微环境下可以相互转化。巨噬细胞在RA发病中的作用已得到充分证实，而M1/M2失衡是否在RA病程中扮演重要角色尚不清楚。本研究重点探讨RA患者外周血中M1及M2型巨噬细胞的表达，初步探讨巨噬细胞极化在RA中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料

27例RA患者来自江苏省人民医院风湿科门诊2015年3月—2016年5月的就诊患者，均符合2009年ACR/EULAR制定的RA诊断标准。排除糖尿病、高血压、感染等疾病。其中，女性23例，男性4例，平均年龄为47岁，病程为1个月～30年。21例年龄和性别匹配的健康对照均来自江苏省人民医院体检中心健康体检者。研究遵循的程序符合本院医学伦理委员会所制定的伦理学标准，并获得该委员会的批准。标本的采集均获得受试者知情同意后完成。

1.2 试剂与仪器

PE-CD68、PE-CD163、APC-CX3CR1及其同型对照抗体均购自美国eBioscience公司；Alexa-Flour 647-CCR2及其同型对照抗体购自美国BD公司；红细胞裂解液，购自杭州联科生物技术有限公司；PCR引物，由美国Invitrogen公司合成；Trizol购自美国Invitrogen公司。

1.3 实验方法

（1）流式细胞术检测外周血M1及M2型巨噬细胞所占比例 收集RA患者及对照组外周血200 μl，分别标记M1型巨噬细胞（CD68、CCR2）及M2型巨噬细胞（CX3CR1、CD163）及其同型对照抗体；加入以1∶10稀释的红细胞裂解液；流式细胞仪检测M1及M2型巨噬细胞所占比例。

（2）其他常用RA实验室项目检测 酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定抗环瓜氨酸（Cyclic citrullinated antibody，CCP）抗体，散射比浊法测定C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）和类风湿因子（RF），魏氏法测定血沉（Erythrocyte sedimentation rate，ESR）等，由本院风湿免疫科实验室和临床检验中心完成。

1.4 统计学分析

采用GraphPad Prism 5分析数据并作图，实验数据以平均值±标准误（Mean±SEM）表示，组间比较采用单因素方差分析及t检验，M1及M2巨噬细胞比例与各临床指标的相关性采用Spearman相关性分析，P＜0.05为差异有统计学差异。

2 实验结果

2.1 RA患者外周血M2型巨噬细胞比例显著低于健康对照者

以单核细胞设门，分析外周血M1及M2型巨噬细胞的比例（图1A）。发现RA患者外周血M1型巨噬细胞比例（2.107%±0.2813%）较健康对照组（1.461%±0.2162%）有所升高，但无统计学差异（图1B）。健康对照组M2型巨噬细胞的比例高达（3.959%±0.350%），而RA患者外周血中M2型巨噬细胞的比例仅为（1.712%±0.217%），具显著统计学差异（P＜0.001，图1C）。进一步分析M1/ M2比值的变化，结果显示RA患者外周血PBMC中M1/ M2比值显著增高（P＜0.01，图1D）。

图1

2.2 RA患者外周血M2型巨噬细胞比例与临床及实验室指标相关性分析

在此基础上，进一步分析了RA患者外周血中M2型巨噬细胞与抗CCP抗体、RF、晨僵时间、关节肿胀及压痛数、疾病活动性评分（Disease Activity Score-28，DAS28）、血沉、C-反应蛋白等与RA疾病活动相关的临床与实验室指标的相关性。结果发现：RA外周血中M2型巨噬细胞比例与ESR、CRP及晨僵时间均呈负相关：分别为：ESR：r=-0.3998，P=0.0388；CRP：r=-0.3810，P=0.0499；晨僵时间：r=-0.3889，P=0.0450（图2A-C）；与其他实验室检查结果无显著相关性（数据未显示）。

图2

3 讨论与结论

有研究提示，敲除M1型巨噬细胞分化调控因子GMCSF后，CIA小鼠关节炎发生率降低，关节炎症状减轻，表示巨噬细胞极化可能参与RA发病过程。此外，RA患者血清中IL-6、IL-8、TNF-α和干扰素-γ（Interferon-γ）水平显著增高，IL-10水平显著降低，表明RA患者体内炎性微环境，可能会影响巨噬细胞极化。本研究中我们经过一系列分析，发现RA患者外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中 M1型巨噬细胞标记CD68及CCR2增高，而M2型巨噬细胞标记CD163及CX3CR1显著降低，说明巨噬细胞，尤其是M2型巨噬细胞在RA发病机制中起重要作用。

综合上述，巨噬细胞极化有可能通过介导炎症和组织损伤，影响Th1和Th2细胞功能，参与RA病理过程。为进一步揭示外周血PBMC中巨噬细胞极化与RA病情的关系，本研究又将巨噬细胞极化水平与代表RA病情活动的几项指标进行了相关性分析。结果发现RA患者外周血M2型巨噬细胞比例与晨僵时间、血沉及C-反应蛋白水平呈正相关，可见外周血巨噬细胞极化水平可作为RA患者病情活动的一个较敏感的指标。由于巨噬细胞极化在免疫和慢性炎症中有十分重要的作用，因此研究其水平变化对全面阐明RA发病机理，获得新的、从不同层面和角度协助判断RA发病与临床活动程度的实验室诊断有促进作用。

[1] Kondo Y，Yokosawa M，Kaneko S et al. Transcriptional regulation of CD4+ T cell differentiation in experimentally-induced arthritis and rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheumatol，2017,15（6）：135-138.

[2] Akinrinmade OA，Chetty S，Daramola AK et al. CD64：An Attractive Immunotherapeutic Target for M1-type Macrophage Mediated Chronic Inflammatory Diseases [J].Biomedicines，2017；12：5.

[3] Wang Y，Han CC，Cui D et al. Is macrophage polarization important in rheumatoid arthritis [J]. Int Immunopharmacol. 2017；50（6）：345-352.

[4] Mosser DM，Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation [J].Nat Rev Immunol，2008；8：958-969.

[5] Jeannin P，Paolini L，Adam C et al. The roles of CSFs on the functional polarization of tumor-associated macrophages [J].FEBS J，2017；23(4):168-177.

[6] Zhou D，Chen L，Yang K et al. SOCS molecules：the growing players in macrophage polarization and function [J].Oncotarget，2015；8(6)：60710-60722.

[7] Hamilton JA. Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity [J].Nat Rev Immunol. 2008；8(2)：533-544.

[8] Pollard JW. Trophic macrophages in development and disease [J].Nat Rev Immunol，2009；9(11)：259-270.