NaCl胁迫下γ—氨基丁酸对兜唇石斛组培苗生长的影响

邓林霞+陈小强+覃美运+张亚鹤

摘要：以兜唇石斛[Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher]试管苗为材料，探讨在不同浓度NaCl胁迫下，不同浓度外源GABA对兜唇石斛组培苗生长的影响，通过测定兜唇石斛组培苗叶片中的脯氨酸含量来确定外源GABA对盐胁迫的缓解效应。结果表明，在相同浓度的NaCl胁迫下，加入GABA可明显提高兜唇石斛组培苗中的脯氨酸含量，说明外源GABA对兜唇石斛组培苗盐胁迫有明显的缓解效应，且缓解效果最佳的外源GABA浓度为7 mmol/L。

关键词：兜唇石斛[Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher]；NaCl胁迫；脯氨酸；γ-氨基丁酸

中图分类号：R282；Q813.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）03-0579-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.048

Effects of Gamma Aminobutyric Acid on the Growth of Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher Seedlings under NaCl Stress

DENG Lin-xia，CHEN Xiao-qiang，QIN Mei-yun，ZHANG Ya-he

（College of Agronomy & Resources and Environment， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384，China）

Abstract： The seedlings of Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher were used as materials to study the different concentrations of NaCl stress， effects of different concentrations of exogenous GABA on the growth of Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher plantlets. The rusults showed that the content of the proline from seedlings in leaves of Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher would determine exogenous GABA on salt stress relieving effects. Finally， in the same concentration of NaCl stress conditions， exogenous GABA would significantly improve the proline content in Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher seedlings. And the optimal concentration of exogenous GABA was 7 mmol/L.

Key words： Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher； NaCl stress； proline； gamma aminobutyric acid

石斛来源于兰科石斛属多种植物的新鲜或干燥茎，是中国历史悠久的名贵中药材，具有益脾生津，滋阴清热的功效，主治热病伤津、胃痛干呕、肺燥干咳、腰膝软弱等症状[1，2]。现代药理试验证明，石斛具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化等多种活性[3-5]。兜唇石斛[Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher]属于兰科（Orchidaceae）植物，分布于中国长江以南（广西、云南、贵州）、尼泊尔、锡金、不丹、印度东北部至中南半岛和马来西亚[6]；生长在400～1 500 m的疏林树干上或山谷岩石上[7]。

兜唇石斛有重要的观赏价值和较高的药用价值。近年来，由于森林砍伐严重、药用开发过多等因素，自然界中石斛蕴藏量逐年减少[8]。且石斛生长速度缓慢，加上繁殖率低等特点，许多优良品种无法大量繁殖以满足日益增长的市场需求。针对这一问题，利用组织培养技术可以扩大石斛兰生产规模。土壤盐渍化是农作物生产中最严重的非生物逆境之一，选育耐盐作物，提高作物对盐渍环境的适应能力，是减轻土壤盐渍化危害的重要途径之一。因此，研究植物耐盐性是植物耐盐育种的基础。目前，石斛的生产多利用设施农业通过温室栽培大量培养，而温室的环境相对封闭，室内的温度较高，导致基质水分大量蒸发，盐分含量增高，不利于兜唇石斛生长发育。所以，研究提高作物耐盐碱性的方法与机理有重要意义。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，简称GABA）又称γ-氨酪酸，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，分布广泛；具有降低血压、控制哮喘、治疗癫痫等功能[9]。研究表明，植物体内γ-氨基丁酸（GABA）能在一定程度上增强逆境胁迫下植物的抗性。盐胁迫条件下GABA对甜瓜[10]、玉米[11]、小麦[12]等的影响已有报道，对GABA缓解兜唇石斛盐胁迫伤害的研究鲜见报道。在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸含量显著增加，脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性。本研究通过对不同浓度NaCl胁迫下，不同浓度外源GABA對兜唇石斛组培苗生长的影响进行分析，建立最适宜兜唇石斛生长的组织培养体系；同时通过测定兜唇石斛组培苗叶片中的脯氨酸含量来确定外源GABA对盐胁迫的缓解效应，筛选出缓解效果最佳的外源GABA浓度，进而为外源GABA引导兜唇石斛抗逆栽培提供理论基础，为石斛抗逆栽培和抗性育种研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

材料为兜唇石斛试管苗，取自天津农学院农学与资源环境学院植物细胞工程研究中心。

1.2 方法

1.2.1 兜唇石斛苗的扩繁 取兜唇石斛试管苗接种于新的培养基中，培养基配方为MS+15 g蔗糖+6.5 g琼脂+2.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA。为保证后续试验所需材料的数量，共培养60瓶，每瓶接种3个种苗，每个种苗高2 cm左右。

1.2.2 NaCl胁迫下GABA对兜唇石斛组培苗生长的影响 设置NaCl的浓度梯度0.4%、0.6%、0.8%，分别加入不同浓度的GABA（0、1、3、5、7、9 mmol/L）（表1），每组配比重复5次。观察培养30 d，通过测定各个浓度配比中组培苗叶片内的脯氨酸含量来确定外源GABA对盐胁迫的缓解效应。

1）制作脯氨酸标准曲线。按照脯氨酸含量的测定方法[13，14]，以脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，其线性回归方程为y=0.023 6x+0.001 3（R2=0.988 2），如图1所示。

2）样品测定。称取0.5 g兜唇石斛叶片放到具塞试管中（3次重复），加入5 mL 3%的5-磺基水杨酸溶液，沸水浴10 min，冷却后吸取上清液。具塞试管中加入2 mL上清液，2 mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮，进行沸水浴30 min。冷却后向具塞试管中加入4 mL的甲苯充分振荡，以萃取红色物质。在3 000 r/min下离心5 min，静置分层后吸取甲苯层，以甲苯溶液为对照，在分光光度计520 nm波长下比色，测得各处理下试管苗中脯氨酸的吸光度。

根据回归方程计算出2 mL测定液中脯氨酸的含量，然后计算样品中脯氨酸含量百分数。计算公式如下[14]：

脯氨酸（μg/g FW或DW）=（C×V/a）/W （1）

式中，C为提取液中脯氨酸含量（μg），由标准曲线求得；V为提取液总体积（mL）；a为测定时所吸取提取液的体积（mL）；W为样品质量（g）。

2 结果与分析

2.1 兜唇石斛苗的扩繁

经过50 d的观察，兜唇石斛的生长状况如图2所示。培养过程中兜唇石斛污染率为0，死亡率为3.25%。在培养基MS+15 g蔗糖+6.5 g琼脂+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培养条件下组培苗的长势最好，叶色由刚开始培养的淡绿变为深绿，植株健壮且无病害。

2.2 NaCl胁迫下GABA对兜唇石斛组培苗生长的影响

在逆境条件下，植物体内的脯氨酸含量显著增加，脯氨酸是植物体内的一种重要调节物质[15]，植物通过不断积累脯氨酸来适应不同的盐碱环境。因此，不同浓度NaCl胁迫下，兜唇石斛苗体内的脯氨酸含量不同。为避免分光光度计测量值造成误差，在测量组培苗中脯氨酸含量前，先绘制脯氨酸的标准曲线，得到脯氨酸浓度（X）与吸光度（Y）的回归方程Y=0.068 1X+0.006 4（R2=0.988 2）。用分光光度计测定组培苗脯氨酸提取液的吸光度，代入回归方程得出不同处理下兜唇石斛组培苗体内所含的脯氨酸浓度；将得到的脯氨酸浓度再代入公式（1），得到脯氨酸含量。加入GABA后，不同NaCl浓度处理下兜唇石斛组培苗叶片内的吸光度、脯氨酸浓度和脯氨酸含量如表2所示。此培养过程中兜唇石斛组培苗的污染率为4.0%，死亡率为7.35%。

由于植物体内GABA能在一定程度上增强逆境胁迫下植物的抗性，由表2中所得数据对比后发现，在相同浓度的NaCl胁迫条件下，加入GABA可显著提高兜唇石斛组培苗中脯氨酸含量，说明外源GABA对兜唇石斛组培苗有明显的缓解效应。

图3为不同浓度NaCl胁迫下，不同浓度GABA对兜唇石斛组培苗叶片内脯氨酸含量的影响。由图3可看出，在相同NaCl浓度胁迫下，组培苗叶片内的脯氨酸含量在一定程度上呈上升趋势；不同NaCl浓度胁迫下，随着GABA浓度的上升，脯氨酸的含量逐渐上升，并在7 mmol/L时达到最高，然后开始下降；在NaCl胁迫的条件下，缓解兜唇石斛组培苗盐胁迫效果最佳的外源GABA浓度为7 mmol/L。

3 小结与讨论

3.1 兜唇石斛的扩繁

外源激素对于兜唇石斛组织培养有着显著影响，6-BA是细胞分裂类激素，有利于细胞的分化及出芽[16，17]。NAA是生长素类激素，对于植物体的生根有重要作用[18]。在MS培养基的基础上加入适宜浓度的6-BA和NAA，可使组培苗生长得更快。

3.2 NaCl胁迫下GABA对兜唇石斛组培苗生长的影响

逆境脅迫下，GABA作为一种特殊的氨基酸，与植物体内碳素和氮素两大代谢途径密切相关，而且外源GABA能够通过参与植株体内活性氧代谢，在调节植物细胞对逆境的适应过程中发挥重要作用[19]。植物遇到生理胁迫和病虫害等逆境条件时，体内的GABA含量会迅速增加[20-22]。正常条件下，植物组织中GABA的内源水平在0.03～32.5 μmol/g（FW），而当植物受到环境胁迫（缺氧、冷害、热刺激以及机械损伤等）时，体内GABA含量会增加几倍或几十倍[23，24]。罗黄颖等[25]研究了外源GABA浸种处理对NaCl胁迫下番茄种子萌发及幼苗生长和生理代谢的影响，结果表明，外源GABA浸种处理能够通过促进番茄种子萌发和幼苗生长缓解盐胁迫的伤害，其中10 mmol/L处理效果较好。赵九洲等[10]研究表明，当GABA喷施浓度在25～50 mmol/L时，对盐碱胁迫下甜瓜幼苗生长有一定缓解作用，其中50 mmol/L缓解盐碱胁迫效果最好，而75 mmol/LGABA无有效缓解作用。田小磊等[11]以玉米黄化幼苗为材料，分析在盐胁迫条件下外源GABA对玉米种子萌发和幼苗生长的影响，推断GABA可通过提高保护酶系统活性缓解盐胁迫对植物的伤害。李岩岩[12]通过分析GABA对小麦生长状况及其生理生化产生的影响，推断出GABA能提高小麦的耐盐性。

本试验研究不同浓度外源GABA对兜唇石斛组培苗在不同浓度NaCl胁迫下的缓解效应，结果表明，在相同浓度NaCl胁迫下，加入GABA可显著提高兜唇石斛组培苗中脯氨酸含量，说明外源GABA对兜唇石斛组培苗有明显的缓解效应；在不同NaCl浓度胁迫下，随着外源GABA浓度的升高，脯氨酸含量逐渐上升，并在7 mmol/L时达到最高，然后开始下降。因此，在NaCl胁迫下，缓解兜唇石斛组培苗盐胁迫效果最佳的外源GABA浓度为7 mmol/L。

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