FAT10基因单核苷酸多态性与肝细胞癌发生相关性分析

聂 磊,薛迎利,李 雅

陕西省肿瘤医院内二科 (西安 710061)

△通讯作者

FAT10基因单核苷酸多态性与肝细胞癌发生相关性分析

聂 磊,薛迎利△,李 雅

陕西省肿瘤医院内二科 (西安 710061)

目的：探讨FAT10基因单核苷酸多态性与肝细胞癌发生的相关性。方法：对肝细胞癌患者和健康对照者共250例进行DNA测序检测FAT10基因SNPs，分析不同基因型与肝癌的相关性。结果：两组研究对象共测得SNPs位点7个，与相应的野生型纯合子相比，+3476T/C、+3607C/G、+3620C/G以及+3809G/T基因型可显著降低肝癌的发生(P<0.05)，但上述多态性位点基因型出现频率与肝癌表型无明显关联(P>0.05)。单体型分析结果表明，各变异等位基因在两组研究对象内均有遗传连锁不平衡现象，常见单体型有AGCTCGT、GGCTCGT、AATCTCG以及AATTTCG四种，AGCTCGT单体型和GGCTCGT单体型可能对肝癌的发生有保护下作用(OR=0.412，95%CI：0.231～0.713；OR=0.434，95%CI：0.221～0.834)，AATTTCG单体型可能对肝癌的发生有促进作用(OR=1.644，95%CI：1.242～2.174)。结论：FAT10基因外显子和侧翼序列SNPs单核苷酸多态性与肝细胞癌发生具有相关性。

肝癌的发生与某些特定基因变异密切相关，是一个多途径、多步骤的过程。通过检测此类基因，探讨其与肝癌发生的相关性，对于肝癌的预防、治疗及预后具有重要的意义。FAT10基因属于类泛素调节子蛋白家族，研究[1]发现其在部分肝癌、肺癌等患者中表达上调，并且其表达水平与淋巴转移、P53基因突变有关，提示FAT10基因在肝癌的发生中具有重要意义。为进一步探讨FAT10基因与肝癌的相关性，对120例肝细胞癌患者和136例健康对照者进行了研究，现报告如下。

资料与方法

1 一般资料 选取2012年1月至2014年1月本院收治的120例肝癌患者(所有患者病理均肝细胞癌)作为观察组和门诊体检的136例健康对照者作为对照组,所有研究对象均知情同意本次研究。观察组男84例，女36例，年龄26～73岁，平均年龄(57.2±2.4)岁；吸烟(每天≥1支，时间≥1年)92例，饮酒(每日≥1次，持续时间≥3个月)82例。对照组健康人群男90例，女46例，年龄24～76岁，平均年龄(55.7±2.6)岁；吸烟101例，饮酒93例。两组一般资料比较无统计学差异(P>0.05)。

2 检测方法 抽取研究对象肘静脉血5 ml，在试管中加入适量EDTA抗凝后立即于-20℃保存。在全血DNA基因提取试剂盒内抽取全血细胞DNA。首先在试剂盒中加入400 μl血液标本，再加入缓冲液，离心沉淀后加入蛋白K溶液，维持溶液于56℃至细胞裂解。将所得溶液置入吸附柱CB3内，加入缓冲液、漂洗液并离心，收集所得液体。紫光分度计测定DNA纯度，当吸光值A260/A280波动于1.8～1.9后，将所得DNA样本置于-60℃保存。利用DNA测序方法对FAT10基因外显子和侧翼序列测序并按照10%的样本量进行二次检测以提高检测准确性。设定PCR反应体系16 μl，包括0.5 μmol/L上下游引物(Ⅰ：上游5’-TAGACATAGAGATCTGCAGC-3’,下游5’-TTCTCCTGAAGGATGCCTGC-3’；Ⅱ：上游5’-TCCTAGGTAACTGTCTTGTC-3’，下游5’-TCCATTGCAAGTCACAATC-3’；Ⅲ：上游：5，-CAGCTCAGTGGCACAAGT-3’,下游5’-ACAAGGTATCAAGACAGA-3’)各1 μl，50mg/LDNA模板1 μl，2×MAster Mix8.75 μl，ddH2O5.75 μl。在ABI9700型扩增仪(美国ABI公司生产)上进行扩增，将所得产物纯化后进行测序分型，并使用ABI3130XL测序仪(美国ABI公司生产)对测序产物进行测序分析。 根据DNA测序结果，选择位点时参考系统贪婪算法打分结果。考虑如下因素：①所选位点适合进行基因分型平台分型。②所选位点为杂合子。③所选位点次要等位基因频率不低于5%。④Hardy-Weinberg概率超过0.001。

3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件，采取检验对研究对象的一般资料进行比较。进行拟合优度检验确定对照组各变异基因型是否遵循Hardy-Weinberg遗传定律。采取非条件Logistic回归分析计算相关OR值和CI。采取Haploviw软件对两组研究对象单体型分布进行预测[2]，检验标准为0.05。

结 果

1 FAT10基因SNPs检测结果 两组中共检测得到SNPs7个：分别是+3446C/T、+3476T/C、+3527T/C、+3607T/C、+3620C/G、+3803C/G、+3809G/T,见表1。

表1 FAT10基因SNPs检测显示结果

2 FAT10多态性位点、等位基因以及单体型分布与肝癌发生的相关性 排除+3446C/T位点(次要等位基因频率<5%)、+3803C/G位点(次要等位基因频率<5%)。发现+3476T/C、+3607T/C、+3620C/G、+3809G/T多态性位点在两组研究对象中的分布存在差异(P<0.05)。构建GGCTCGT、AGCTCGT、AATTTCG和AATCTCG四种单体型，发现GGCTCGT、AGCTCGT单体型对肝癌的发生有抑制作用(OR=0.412，95%CI：0.231～0.713；OR=0.434，95%CI：0.221～0.834)，AATTTCG单体型对肝癌的发生有促进作用(OR=1.644，95%CI：1.242～2.174)，见表2。

3 FAT10多态性位点基因型分布与肝癌表型相关性 FAT10多态性位点基因型分布情况与肝癌肿瘤数目、大小、癌转移等情况无明显关联(P>0.05)，见表3。

表2 两组患者FAT10基因SNPs基因型、等位基因及单体型分布情况

注：*：+3607T/C位点分布与+3476T/C位点一致;∆：+3809G/T位点分布与+3620C/T位点一致

表3 观察组FAT10多态性位点基因型分布与肝癌表型相关性

注：:在观察组+3476T/C，+3607T/C，+3620C/G，+3803C/G，+3809G/T基因型位点分布与+3446C/T位点一致

讨 论

肝癌治疗的关键在于早期发现、及时切除原发灶并尽可能防止其发生远处转移。研究[3-4]表明，超过76%的肝癌患者确诊时为中晚期，此时肿瘤多已发生肝内、临近器官、骨、肺、脑等多处转移，此时化疗、局部放疗、索拉菲尼等综合治疗不能明显改善生存。因此，肝癌的早期诊断及治疗对于改善患者的预后具有重要的意义。目前常用的肝癌检测指标有AFP、CEA等，但在肝癌早期此类指标升高并不明显，对于早期诊断肝癌的临床应用价值不高[5]。

FAT10属于类泛素调节子蛋白家族，高芸等人研究[6]表明，FAT10基因主要在细胞核内表达，其生成的FAT10蛋白在细胞分裂早期、中期，具有干扰着丝粒定位作用，导致分裂过程中染色体的稳定性下降，在多种上皮源性肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。此外，在祝鹏等人的研究中[7]，对胰腺癌患者和健康人群FAT10表达水平进行检测，发现93%胰腺癌患者样本中FAT10mRNA的检测量超过1200bp，并且有超过80%的胰腺癌样本中FAT10蛋白表达量显著高于对照组健康人标本，提示FAT10基因型可能在胰腺癌的发生发展中亦具有重要的价值。余小琴等人[8]在对183例女性生殖系统恶性肿瘤患者和193例健康对照者的研究中发现，发现恶性肿瘤患者体内FAT10基因表达量显著高于健康对照样本，并且FAT10基因的表达水平与患者的生存期、淋巴结转移及TNM分期密切相关。近年来的各种研究[9-10]也证实了FAT10基因在部分恶性肿瘤发生过程的重要作用。但是当前关于FAT10基因与肝癌发生相关性报道较少。本次实验就FAT10基因SNPs位点与肝癌发生的相关性进行了研究。

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)是个体表现出不同遗传易感性的关键，可改变个体对某种疾病的易感性，对某些恶性疾病可起到促进或抑制作用。因此通过基因检测技术发现对某些疾病具有促进作用的“恶性SNP”，可对此类疾病的预防和治疗具有重要意义。在本次研究中，对120例肝癌患者和136例健康对照者进行了DNA测序检测FAT基因SNPs位点，共得到SNPs7个，并且发现+3476T/C，+3607T/C，+3620C/G，+3809G/T多态性位点在两组研究对象中的分布存在显著差异(P<0.05)，提示此等位点的出现对于肝癌的发生具有抑制作用，结合相关研究[11]，分析+3476T/C，+3607T/C，+3620C/G，+3809G/T多态性位点由于处于第二外显子区域，可引起mRNA翻译时氨基酸的替换，而此类替换能够改变FAT10基因编码蛋白质的性质，降低机体肝癌易感性，然而此推测的准确性还需进一步研究。同时，本次实验对于不同单体型进行分析，根据结果发现GGCTCGT、AGCTCGT对肝癌的发生有保护下作用，AATTTGG单体型对肝癌的发生有促进作用，但是由于本次研究是在群体水平上进行分析，未针对个体去除吸烟、年龄、性别等干扰因素作用，所得结论仍具有一定的局限性，需在个体水平上进行更为深入的研究来验证所得结果准确性。此外，本次研究还对FAT10基因多态性位点与肝癌临床表型的关联性进行了分析，但是并未发现不同位点基因型与肝癌患者的肿瘤大小、是否发生转移等临床表型具有显著的相关性，提示此等多态性位点与肝癌的临床表型无确定性联系，但仍需大样本量研究予以证实。

综上所述，本次研究对FAT10基因外显子和侧翼序列区单核苷酸多态性与肝癌的相关性进行了研究，得到了肯定结论，对于肝癌的早发现及治疗具有重要意义。

[1] 林 昀,张云丽,胡 昕，等.PEG10基因在肝癌组织中高表达的分子机制及其功能的研究[J].肿瘤,2013,33(1):28-35.

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[3] 赵增富,王茹芳,赵付宪，等.肝动脉栓塞联合射频消融治疗肝癌40例疗效评价[J].陕西医学杂志,2014,43(5):587-588.

[4] 王志亮,徐长胜,徐 心,等.复发性肝癌86例治疗体会[J].陕西医学杂志,2012,41(2):172-173,176.

[5] 刘 琦.联合检测AFP、AFP-L3在肝癌诊断中的应用价值[J].陕西医学杂志,2013,42(7):905-906.

[6] 高 芸,李少一,商雪莹，等.RNAi沉默NF-κB p65基因对肝癌细胞FAT10表达的影响[J].中国医科大学学报,2013,42(5):385-387.

[7] 祝 鹏,王伟军.腺癌癌前病变基因研究进展[J].肿瘤防治研究,2014,41(10):1134-1138.

[8] 余小琴,江蓓蕾,方 勇，等.DNA倍体分析联合高危型HPV检测预测宫颈上皮内瘤变[J].中华妇产科杂志,2013,48(6):459-461.

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[10] 李少一,王志超,高 芸，等.RNAi沉默Stat1基因对胶质瘤细胞FAT10表达的影响[J].中国老年学杂志,2013,33(11):2564-2566.

[11] Liu L,Dong Z,Liang J，etal.As an independent prognostic factor, FAT10 promotes hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma progression via Akt/GSK3β pathway[J].Oncogene,2014,33(7):909-920.

(收稿：2016-06-28)

Analysis of relationship between single nucleotide polymorphism of FAT10 gene and progression of hepatocellular carcinoma

Nie Lei,Xue Yingli, Li Ya .

The Second Department of Medical Oncology,Shaanxi Provincial Tumor Hospital(Xi’an 710061)

Objective：To analysis the relationship between single nucleotide polymorphism of FAT10 gene and progression of hepatocellular carcinoma.Methods：120 patients with HCC and 136 healthy people were recruited.All subjects were genotyped by DNA sequencing to discuss the relationship between different genotypes and liver HCC. Results ：7 SNPs were identified in all subjects.The +3476T/C, +3607C/G, +3620C/G and +3809G/T genotype significantly reduce the incidence of HCC (P<0.05),but no SNPs were associated with disease clinicopathology(P>0.05).Estimated by haploview software,genetic linkage disequilibrium existed in both groups,AGCTCGT、GGCTCGT、AATCTCG and AATTTCG were four common haplotypes ,haplotype AGCTCGT and haplotype GGCTCGT were related to reduced HCC risk(OR=0.41，95%CI：0.231～0.713；OR=0.43，95%CI：0.221～0.834),AATTTCG haplotype may promote the occurrence of HCC(OR=1.64，95%CI：1.242～2.174). Conclusion ：FAT10 gene SNPs is involved in the susceptibility of HCC,while further study is required to confirm this hypothesis by expanding the sample size.

Lievr neoplasms,experimental/immunology @FAT10 gene Polymorphism,Single nucleotide

肝肿瘤，实验性/免疫学 @FAT10基因 多态现象，单核苷酸

R363

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.03.008