抑制CR3并阻断NF-κB通路改善轴突再生环境的实验研究*

刘仲凯,郝定均,贺宝荣,方向义,尹新华

西安交通大学附属西安市红会医院脊柱外科矫形病区(西安710054)

抑制CR3并阻断NF-κB通路改善轴突再生环境的实验研究*

刘仲凯,郝定均∆,贺宝荣,方向义,尹新华

西安交通大学附属西安市红会医院脊柱外科矫形病区(西安710054)

目的：对抑制CR3并阻断NF-κB通路改善轴突再生环境进行研究，为临床治疗提供参考。方法：将 C57BL/6J小鼠随机分为对照组、脊髓损伤模型组、脊髓损伤后椎扳切除术组、脊髓损伤后SN50治疗组、脊髓损伤后SN50M治疗组、脊髓损伤后注射XVA143组和脊髓损伤后硼替佐米治疗组七组各10只，检测并分析各组小鼠体内CR3、NF-κB因子及MEK/ERK通路蛋白表达变化。结果：与对照组相比，脊髓损伤小鼠血清中CR3、CR1、NF-κB、TGF-β和VEGF、IL-1β、IL-2、IL-6、MEK、ERK、Ras和Raf蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，而经药物治疗后上述异常表达的蛋白得到明显的恢复(P<0.05)。结论：脊髓损伤小鼠存在明显的CR3和NF-κB通路异常，药物能够通过抑制上述通路改善轴突再生环境。

Kwy words Spinal cord injuries/physiopathology Axons Nerve regeneration Inflammation Interleukins @MEK/ERK pathway Receptors,complement

脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)其救治和截瘫功能康复是神经科学研究中的世界性难题[1-2]。伴随SCI的炎症反应产生显著的神经病理问题，也是影响功能恢复的重要因素[3]。补体受体-3(CR3)可能对髓磷脂激活NF-κB信号传导通路及髓磷脂诱导的炎症反应有重要作用[4]。CR3拮抗剂XVA143已经用于小鼠牙周炎的模型及其他阻断CR3功能、抑制体内炎症的动物模型，有望用于炎性疾病如脊髓损伤的潜在治疗[5]。增强脊髓损伤中髓磷脂的清除，可能是去除髓磷脂抑制轴突的再生及解决脊髓损伤中炎症反应问题的首要条件[6]。本研究对抑制CR3并阻断NF-κB通路改善轴突再生环境进行研究，为临床治疗提供参考。

材料与方法

1 动物及分组 清洁级C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物中心，体重22～25 g，雌性不拘。所有动物实验前均适应性饲养1周，维持(22±2)℃，55%±5%。所有动物实验操作均符合实验动物福利的相关要求。C57BL/6J小鼠随机分为七组：对照组、脊髓损伤模型组、脊髓损伤后的椎扳切除术组、脊髓损伤后SN50治疗组、脊髓损伤后SN50M治疗组、脊髓损伤后注射XVA143组和脊髓损伤后硼替佐米治疗组(n=10)。

2 试剂及来源 CR3蛋白检测试剂盒购自Omega公司；CR1蛋白检测试剂盒购自Amresco公司；NF-κB蛋白检测试剂盒购自Abcam公司；TGF-β和VEGF蛋白检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；IL-1β蛋白检测试剂盒购自Abcam公司；IL-2、IL-6蛋白检测试剂盒购自Sigma公司；MEK蛋白检测试剂盒购自R&D公司；ERK蛋白检测试剂盒购自Snata Cruz公司；Ras和Raf蛋白检测试剂盒购自Elab Sciences公司。

3 脊髓损伤小鼠模型复制 除对照组小鼠给予磷酸缓冲液注射外，其余各组小鼠给予注射髓磷脂(1μl)复制脊髓损伤模型小鼠。各组治疗组小鼠按如下方法进行治疗：脊髓损伤后SN50组小鼠在脊髓损伤之后立即注射SN50(20 μg/kg加入到 0.5 μl PBS)到打击的中心和边缘(0.5μl/单位)，然后用微量灌流泵将既定浓度的SN50以6 μg/(kg·h)持续硬膜下给药到术后4周；脊髓损伤后SN50M治疗组小鼠给予SN50M治疗；脊髓损伤后硼替佐米治疗组小鼠脊髓损伤后立即注射硼替佐米(1 mg/kg加入到0.5 μl PBS)到脊髓损伤的部位，然后持续给予硼替佐米(0.2mg/kg，每周2次)致术后4周；脊髓损伤后注射XVA143组小鼠脊髓损伤后立即注射XVA143(0.5 μl/单位)到损伤的中心和边缘，然后通过微量灌流泵以持续硬膜下给予XVA143[1mM/(只·d) ]至术后4周。

4 观察指标 本研究分析各组小鼠治疗前后血清中炎症因子CR-3、CR-1、NF-κB、TGFβ和VEGF水平变化，并检测白细胞介素蛋白家族IL-1β、IL-2、IL-6水平变化，检测ERK信号转导通路关键蛋白MEK、ERK、Ras和Raf蛋白水平变化。

结 果

1 脊髓损伤小鼠血清中CR3蛋白变化及药物干预作用分析 与对照组相比，脊髓损伤小鼠血清中CR3及CR1蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，而经药物治疗后上述异常表达的蛋白得到明显的恢复(P<0.05)，见表1。

表1 脊髓损伤小鼠血清CR3蛋白变化及药物干预作用

2 脊髓损伤小鼠血清中NF-κB蛋白变化及药物干预作用分析 与对照组相比，脊髓损伤小鼠血清中NF-κB、TGFβ和VEGF蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，而经药物治疗后上述异常表达的蛋白得到明显的恢复(P<0.05)，见表2。

表2 脊髓损伤小鼠血清NF-κB蛋白变化及药物干预作用

3 脊髓损伤小鼠血清中白细胞介素蛋白变化及药物干预作用分析 与对照组相比，脊髓损伤小鼠血清中白细胞介素蛋白IL-1β、IL-2和IL-6表达水平明显升高(P<0.05)，而经药物治疗后上述异常表达的蛋白得到明显的恢复(P<0.05)，见表3。

表3 脊髓损伤小鼠血清白细胞介素蛋白变化及药物干预作用

4 脊髓损伤小鼠血清中MEK和ERK蛋白变化及药物干预作用分析 与对照组相比，脊髓损伤小鼠血清中MEK和ERK蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，而经药物治疗后上述异常表达的蛋白得到明显的恢复(P<0.05)，见表4。

表4 脊髓损伤小鼠血清MEK和ERK1/2蛋白变化及药物干预作用

5 脊髓损伤小鼠血清中Ras和Raf蛋白变化及药物干预作用分析 与对照组相比，脊髓损伤小鼠血清中Ras和Raf蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，而经药物治疗后上述异常表达的蛋白得到明显的恢复(P<0.05)，见表5。

表5 脊髓损伤小鼠血清Ras和Raf蛋白变化及药物干预作用

讨 论

脊髓损伤是脊柱损伤的最严重的并发症，且其发生率有逐年增高的趋势。脊髓损伤后的病理学改变相当复杂，包括脊髓出血、神经元和胶质细胞坏死、肿胀以及星形胶质细胞(AS)反应性胶质化等[7],临床通常表现为损伤节段以下肢体的严重的功能障碍，给患者和家庭带来沉重的负担。脊髓损伤后的炎症反应是引起脊髓继发性损伤的重要因素。肿瘤坏死因子、白细胞介素1β、白细胞介素10、髓过氧化物酶等炎症因子可刺激其他细胞因子和炎症介质的产生，这些细胞因子还可作为内皮细胞活化的信号，刺激细胞粘附分子的产生及白细胞-内皮细胞粘附，诱导白细胞向损伤区浸润[8]。伴随脊髓损伤的炎症反应产生显著的神经病理问题，影响患者的功能恢复。脊髓中浸润的炎性细胞及固有胶质细胞产生促炎介质，引发了一系列病理级联反应，导致了炎症及神经的损害。轴突对机械损伤和炎症介质毒性的极其敏感性由此可能致轴突脱髓鞘。在脊髓损伤中，脱髓鞘长期存在，变性的髓磷脂显著抑制轴突的再生。除了能抑制神经的再生，髓磷脂也有触发额外的炎症反应，导致组织的损伤。本研究在对抑制CR3并阻断NF-κB通路改善轴突再生环境进行研究时发现与对照组相比，脊髓损伤小鼠血清中CR3、CR1、NF-κB、TGF-β和VEGF、IL-1β、IL-2、IL-6、MEK、ERK、Ras和Raf蛋白表达水平明显升高，而经药物治疗后上述异常表达的蛋白得到明显的恢复。其中，血清TNF-β水平呈早期水肿样表达增强[9]。因此，脊髓损伤小鼠存在明显的CR3和NF-κB通路异常，药物能够通过抑制上述通路改善轴突再生环境。

NF-κB是细胞内最常见的炎症反应因子，其水平异常也与脊髓损伤及神经系统异常密切相关[10-11]。在分析活血通督汤对脊髓缺血再灌注损伤NF-κB、VCAM-1表达作用的研究中发现活血通督汤能有效改抑制NF-κB、VCAM-1的表达，从而减轻炎性反应,以期达到减轻脊髓缺血再灌注损伤[12]。在分析番茄红素影响NF-κB表达对脊髓损伤后大鼠神经功能恢复作用的研究中也证实番茄红素可以通过抑制NF-κB的表达降低急性脊髓损伤后的炎症反应对组织的损伤，并促进大鼠神经和运动功能恢复[13]。在研究不同剂量阿托伐他汀钙对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脊髓内NF-κB表达及血清炎性因子影响时也发现高剂量阿托伐他汀钙能降低大鼠EAE的发病率及病情严重程度,可能与其抗炎及免疫调节机制有关[14]。在对慢病毒介导RNAi沉默大鼠脊髓神经元NF-κB p65基因影响的研究中也发现构建大鼠神经元NF-κB p65基因的RNAi慢病毒载体，它可使大鼠脊髓神经元NF-κB p65基因表达下调[15]。在分析神经病理性疼痛大鼠脊髓NF-κB、NR2B和iNOS的表达及意义时也证实CCI大鼠痛觉过敏的产生和维持可能与脊髓NF-κB和NR2B活化并上调iNOS表达水平有关[16]。以往的研究还发现BDNF很可通过上调Bcl-2的表达参与脊髓继发性损伤[17]，而且雌激素能抑制EAE大鼠NF-κB和Rho激酶的表达，其对Rho激酶的抑制作用可能部分通过下调NF-κB的水平实现的[18]。本研究也发现脊髓损伤小鼠血清中NF-κB蛋白表达水平明显升高，而经药物治疗后上述异常表达的蛋白得到明显的恢复，表明脊髓损伤小鼠存在明显的NF-κB通路异常，药物能够通过抑制上述通路改善轴突再生环境。

MEK/ERK信号转导通路参与了细胞外信号向细胞内转导的主要过程，也是脊髓功能维系及损伤的主要调控通路[19-20]。在研究CXCL12/CXCR4对大鼠少突胶质前体细胞迁移的影响及调控时发现CXCL12/CXCR4能够通过MEK1/2通路调控大鼠OPCs的迁移，为后续深入探讨脊髓损伤治疗方法提供实验基础[21]。在研究ERK1/2在实验性自身免疫性脑脊髓炎发病过程中的组织特异性作用中也发现ERK1/2的表达在EAE发病过程中存在组织特异性[22]。在分析MEK抑制剂对脊髓损伤后胶质瘢痕形成的影响时也证实MEK抑制剂能通过抑制星形胶质细胞的增殖，下调GFAP及Vim的表达，减少胶质瘢痕形成;同时可促进脊髓损伤后大鼠双后肢行为学及神经功能的恢复[23]。在研究MEK抑制剂抑制吗啡依赖及戒断大鼠脊髓神经元NOS表达的研究中也发现MEK抑制剂能减轻吗啡依赖及戒断大鼠的戒断症状和在脊髓水平抑制NOS的表达,表明ERK可能参与调控NOS的表达[24]。本研究也发现脊髓损伤小鼠血清中MEK、ERK、Ras和Raf蛋白表达水平明显升高，而经药物治疗后上述异常表达的蛋白得到明显的恢复，表明脊髓损伤小鼠存在明显的NF-κB通路异常，药物能够通过抑制上述通路改善轴突再生环境。

因此，脊髓损伤小鼠存在明显的CR3和NF-κB通路异常，药物能够通过抑制上述通路改善轴突再生环境。

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(收稿：2016-08-05)

The relationship research on CR3 and NF-κB pathway inhibition with the environmental improvement of axon regeneration

Liu Zhongkai, Hao Dingjun, He Baorong, et al.Department of Spinal Surgery,Honghui Hospital,Xi’an Jiaotong University School of Medicine(Xi’an 710054)

Objective: The present research aimed to explore the relationship on CR3 and NF-κB pathway inhibition with the environmental improvement of axon regeneration. Methods : Clean C57BL/6J mice were divided into 7 groups randomly. The Spinal cord injury mice were duplicated with the injections of myelin. The serum inflammatory factors of NF-κB and MEK/ERK pathway related proteins were assayed. Results The results showed that the serum CR3, CR1, NF-κB, TGF-β, VEGF, IL-1β, IL-2, IL-6, MEK, ERK, Ras and Raf concentration were increased greatly in spinal cord injury mice when compared with control (P<0.05). At the meaning time, these parameters were normalized greatly after the medication of drugs (P<0.05). Conclusion: Abnormal NF-κB and CR3 signaling pathway are involved in the pathogenesis of spinal cord injury in mice and drugs can alleviate the injury by inhibiting the aforementioned pathway.

*陕西省自然科学基金资助项目(2012JM4046)

脊髓损伤/病理生理学 轴突 神经再生 炎症/病理生理学 白细胞介素类 @MEK/ERK信号转导通路 受体，补体

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.03.003

∆通讯作者