热疗联合5-氟尿嘧啶对胃癌MKN45细胞抑制作用机制研究

安 琳,苏慎勇∆ ,杨卫东,张 祎,许 敏, 李海飞, 李 磊, 朱红伟,王素娟,汤若琪

1.河北大学附属医院肿瘤内科(保定071000), 2.河北省保定市第二医院放射科(保定 071000),3.河北医科大学(石家庄 050017)

△通讯作者

热疗联合5-氟尿嘧啶对胃癌MKN45细胞抑制作用机制研究

安 琳1,苏慎勇1∆,杨卫东2,张 祎2,许 敏2, 李海飞2, 李 磊2, 朱红伟2,王素娟2,汤若琪3

1.河北大学附属医院肿瘤内科(保定071000), 2.河北省保定市第二医院放射科(保定 071000),3.河北医科大学(石家庄 050017)

目的：探讨5-氟尿嘧啶(5-Fu)温热化疗对人低分化胃癌细胞(MKN45细胞)抑制的分子作用机制。方法：以MTT法测定MKN45细胞48h的IC50作为实验工作浓度，实验分对照组(C)、热疗组(H)、化疗组(D)、热化疗组(HD)，检测细胞抑制率；应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察表皮生长因子受体EGFR与原癌基因RAS mRNA的表达变化。结果：热、化疗均可抑制MKN45细胞系 (P<0.05)，热化疗抑制作用更明显(P<0.05)；RT-PCR分析显示，热化疗组EGFRmRNA与RASmRNA表达下调最明显(P<0.05)。EGFR mRNA与RAS mRNA的表达呈明显的正相关性(r=0.870，P<0.05)，细胞抑制率与EGFRmRNA表达水平间存在负相关关系(r=-0.956，P<0.05)，细胞抑制率与RASmRNA表达水平间存在负相关关系(r=-0.923，P<0.05)。结论：化疗联合热疗能显著增加对MKN45细胞的体外抑制作用，其机制可能与下调EGFR与RAS的表达及二者相互作用有关。

胃癌是我国最多见的恶性肿瘤之一，发病率较高，由于胃癌早期临床症状缺乏特异性，因而确诊时往往多属于中晚期。5-Fu是抑制肿瘤细胞S期的特异性药物,转化成的细胞毒性代谢产物，抑制DNA合成导致肿瘤细胞凋亡和周期停滞。研究显示,EGFR4 抑制剂PD173074与5-Fu联用可阻滞细胞周期，抑制增殖，诱导凋亡[1]。通过恒温热水浴加热肿瘤组织，杀灭癌细胞的方法近些年有了新的进展[2-3]。因此两种方法联合应用可以发挥协同作用，以提高病人的生存率和延长无进展生存期[4]。

材料和方法

1 药品与试剂 盐酸5-氟尿嘧啶；RPMI 1640；四氮甲唑蓝(MTT)； RT-PCR试剂盒；引物。

2 细胞及其培养 人胃癌细胞株(MKN45)。将细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，37℃恒温，5%CO2饱和湿度环境中传代培养，取对数生长期细胞进行实验。

3 5-氟尿嘧啶实验浓度的确定 (根据文献资料及预实验结果)将5-氟尿嘧啶分为50、100、200 mg/ml 三个不同浓度组，计算IC50值作为实验浓度。

4 细胞的分组与处理 37℃培养箱中常规培养对照组(C组)细胞；化疗组(D组)加IC50值的5-Fu；热疗组(H组)将培养瓶浸没于43℃水中 (波动幅度≤±0.2℃)加热时间为60 min继续培养；温热化疗组(HD组)同上。

5 MTT法测定细胞增殖抑制率确定工作浓度对数生长期的MKN45细胞，以5×104个/ml密度接种于每孔180 ml的96孔培养板。24 h后按实验分组加药和(或)加温，继续培养12、24、48 h后加MTT，加二甲基亚砜(DMSO) 150 ml，每组设3个复孔，全自动酶标仪测吸光度(OD值)，细胞增殖抑制率=(对照组OD均值-实验组OD均值)/对照组OD均值×100%。

6 RT-PCR检测上述各组MKN45细胞EGFR、RAS的mRNA表达 Trizol法提取细胞总RNA, 紫外分光光度计检测浓度。EGFR 18上游引物5′-CCATGTCTGGCACTGCTTTC-3′下游引物5′-TACAGCTTGCAAGGACTCTGG-3′，扩增产物215bp；K-RAS上游引物5′-AAAGGTACGGTGGAGTATTTGATAGTG-3′下游引物5′-TCATGAAAATGGTCAGAGAAACCT-3′扩增产物169bp；β-actin上游引物5′-AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3′下游引物5 ′-ACTCATCGTACGCCTGCTTGCTGA-3′扩增产物480 bp；由上海生物工程有限公司合成。PCR反应体系共25 ml，包含cDNA2 ml；上、下游引物各2.5 ml；绿色体系(含TaqDNA聚合酶、MgCl2等)12.5 ml；DEPC水5.5 ml。循环参数为：①EGFR：95℃ 预变性30 s，65℃变性30 s，72℃退火45 s，72℃延伸7 min，33个循环后 72℃延伸5 min终止反应。②RAS：95℃预变性30 s，55℃变性30 s，72℃退火30 s，72℃延伸7 min，33次循环后终止反应。③β-actin：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，35次循环后，72℃延伸7 min终止反应。目的基因和β-actin各6μl，EB染色，于1%琼脂糖凝胶电泳，电泳后于紫外透射仪观察并照相，输入微机应用法国VL公司BIO-PROFIF凝胶图象分析系统分析软件对目的电泳条带进行分析，扩增产物的光密度值(D)，结果以两者光密度的比值表示。mRNA表达相对值=目的片段光密度值/β-actin光密度值。以表达强度≥0.10的值定为阳性表达。实验重复3次[4-5]。

结 果

1 确定5-氟尿嘧啶实验浓度及MKN45细胞增殖抑制率 5-氟尿嘧啶对MKN45细胞的抑制作用存在时间、浓度依赖性。200μg/ml为5-氟尿嘧啶的48 h IC50值，见表1、2。

2 RT-PCR半定量检测细胞内EGFR mRNA、RAS mRNA水平表达变化 RT-PCR分析热化疗组细胞的EGFR、RAS的表达降低最显著 (P<0.05)，见表3。

表1 5-氟尿嘧啶对MKN45细胞增殖抑制的作用

注：▲ IC值大于50%

表2 各组细胞增殖抑制率

注：HD组与C、D、H组比较，P<0.05

表3 各组EGFR、RAS mRNA表达

注：HD组与C组、D组、H组比较，P<0.05

讨 论

热疗对肿瘤细胞有直接杀伤作用，并可通过调节相关基因表达引起细胞凋亡。胡萍萍等[6]报道,瘤体注射鸦胆子乳剂加5-氟尿嘧啶联合中药治疗胃肿瘤可收到较好疗效。有研究表明，热疗联合5氟尿嘧啶通过下调BCL-2和上调Hsp70促进人胃癌细胞SGC-7901的凋亡和增强耐热性，二者有协同作用增强化疗敏感性[7]。

RAS在传递细胞生长分化信号方面起重要作用。作为原癌基因的ras基因被激活以后就变成有致癌活性的癌基因。Ras下游通路 Ras/Raf通路Rho/Rac通路可从以下几方面阻断Ras/MAPK信号转导途径：①酪氨酸蛋白激酶抑制剂，广泛抑制ErbB22或(和)EGFR过表达的肿瘤生长；②抑制Ras法尼基化；③反义核苷酸技术：Harish Chandra Pal和Zhang G实验结果表明靶向EGFR/VEGFR2通路，诱导非小细胞肺癌细胞的凋亡，抑制增殖[8-9]。Ouyang L发现植物血凝素靶向作用于人类乳腺癌MCF-7细胞EGFR介导的Ras-Raf-MEK-ERK通路，诱导细胞凋亡和自噬，因此可以作为一种新型抗肿瘤药物[10]。Han SY用通光藤提取物(5、10、20 g/kg)分别作用于非小细胞肺癌细胞异种移植的裸鼠模型，抑制EGFR介导的信号转导，其减少瘤重和促进凋亡作用呈剂量依赖性。20 g/kg是最有效剂量，联合吉非替尼可有效治疗非小细胞肺癌[11]。Thang ND实验用100 nM紫杉醇治疗威罗菲尼耐药的SKMEL-28黑色素瘤细胞，在SKMEL-28R 细胞株中pAKTs的磷酸化水平升高，促进细胞凋亡，RAS和 pAKTs表达降低，降低细胞增殖、侵袭和克隆。在A375PR, A375MR 和 SKMEL-28R突变的三种细胞株中降低，证实降低MEK 和 ERK水平的磷酸化，在RAS/RAF/MEK/ERK信号通路中起关键作用。结果证实依赖于BRAFV600E突变，对威罗替尼耐药细胞株SKMEL-28R，紫杉醇与威罗替尼可联合应用提高效率[12]。实验表明阻断阴茎癌细胞中EGFR-RAS通路，降低EGFR过表达，应用EGFR抑制剂成为治疗新策略[13]。Okada 等[14]通过抑制EGFR介导的信号通路RAS/RAF/MEK和 PI3K/AKT ，抗EGFR抗体西妥昔单抗抑制直肠癌细胞生长，侵袭，转移，诱导细胞凋亡。

本实验结果表明，热化疗组MKN45细胞处理48h后MTT和RT-PCR进行检测细胞抑制率、EGFR mRNA和K-RAS mRNA的表达水平。结果发现热化疗后EGFR和RAS的mRNA表达降低显著。表皮生长因子受体抑制剂(EGFR)表达于正常上皮细胞表面，而在一些肿瘤细胞中常过表达，EGFR的过表达和肿瘤细胞的转移、侵润、预后差有关。EGFR下游的信号转导通路主要有两条：一条是Ras/ Raf/ MEK/ERK-MAPK 通路，而另一条是PI3K/Akt/mTOR通路。 Ras蛋白为膜结合型的GTP/GDP结合蛋白，相对分子质量为2.1万，Ras(P21)蛋白位于细胞膜内侧，它在传递细胞生长分化信号方面起重要作用。作为原癌基因的ras基因被激活以后就变成有致癌活性的癌基因。由此可提示通过下调EGFR和RAS表达而抑制胃癌细胞生长, EGFR有可能通过RAS因子水平的调节起作用。热疗和5-氟尿嘧啶联用明显抑制细胞增殖。

综上所述, 热疗联合5-氟尿嘧啶化疗能通过抑制细胞生长使5-氟尿嘧啶应用提高效率，可以推测热疗联合5-氟尿嘧啶化疗为肿瘤治疗提供广阔的应用前景。

[1] Ye YW, Hu S, Shi YQ.Combination of the FGFR4 inhibitor PD173074 and 5-fluorouracil reduces proliferation and promotes apoptosis in gastric cancer[J]. Oncol Rep，2013，30(6):2777-2784.

[2] Saitoh Y, Yoshimoto T, Kato S.Synergic carcinostatic effects of ascorbic acid and hyperthermia on Ehrlich ascites tumor cell[J].Exp Oncol，2015，37(2):94-9.

[3] Kim YS, Lee TH, O'Neill BE.Non-lethal heat treatment of cells results in reduction of tumor initiation and metastatic potential[J].Biochem Biophys Res Commun，2015，464(1):51-6.

[4] Liu T, Ye YW, Zhu AL. Hyperthermia combined with 5-fluorouracil promoted apoptosis and enhanced thermotolerance in human gastric cancer cell line.SGC-7901[J].Onco Targets Ther， 2015 ，27(8):1265-70.

[5] 张 祎，杨卫东，于惠玲.热疗联合5氟尿嘧啶影响胃癌MKN45细胞的体外抑制、凋亡的研究[J].中国综合临床,2015 , 31(1):391.

[6] 胡萍萍，金春晖，俞惠新，等.中西药局部注射联合灌服开道散对人胃癌裸鼠移植瘤的实验研究[J].陕西中医，2009，30(9)：1258-1259.

[7] 魏素菊，张 祎.热疗联合表柔比星影响胃癌MGC803细胞的体外抑制、凋亡的研究[J].中国老年学,2011,31(13):2524-2526.

[8] Harish CP, Samriti S. Leah ray strickland delphinidin reduces cell proliferation and induces apoptosis of non-small-cell lung cancer cells by targeting EGFR/VEGFR2 signaling pathways [J].Plos One,2013,8(10) :108-110.

[9] Zhang G, Ye X, Ji D.Inhibition of lung tumor growth by targeting EGFR/VEGFR-Akt/NF-κB pathways with novel theanine derivatives[J]. Oncotarget, 2014 ,5(18):8528-43.

[10] Ouyang L , Chen Y , Wang XY.Polygonatum odoratum lectin induces apoptosisand autophagy via targeting EGFR-mediated Ras-Raf-MEK-ERK pathway in human MCF-7 breast cancer cells[J]. Phytomedicine, 2014,21 (12): 1658-65.

[11] Han SY , Zhao W , Sun H. Marsdenia tenacissima extract enhances gefitinib efficacy in non-small cell lung cancer xenografts[J].Phytomedicine, 2015 ,22 (5): 560-7.

[12] Thang ND,Nghia PT,Kumasaka MY.Treatment of vemurafenib-resistant SKMEL-28 melanoma cells with paclitaxel[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2015 ,16 (2): 699-705.

[13] Gou HF, Li X,Qin M.Epidermal growth factor receptor (EGFR)-RAS signaling pathway in penile squamous cell carcinoma [J].PLoS One,2013,8(4): e62175.

[14] Okada Y, Miyamoto H, Goji T.Biomarkers for predicting the efficacy of anti-epidermal growth factor receptor antibody in the treatment of colorectal cancer[J]. 2014,89(1):18-23.

(收稿：2016-06-02)

The inhibitive effect of gastric carcinoma cell line MKN45 with hyperthermia and 5-Fu in vitro An Ling,Su Shenyong,Yang Weidong,et al.

Medical Oncology, Second Hospital of Hebei Baoding(Baoding 071000)

Objective: To observe the inhibitive effect of MKN45 cells with 5-Fu and hyperthermia,and discusses its mechanism. Methods: MTT assay determine the inhibiting concentration 50%(IC50)at 48 hours as its working concentration.The cells were divided into control、chemotherapy、hyperthermia and hyperthermia combined with chemotherapy groups.The EGFR mRNA and RAS mRNA were determined by RT-PCR . Results: 5-Futhermo-chemotherapy showed the most obvious inhibition to MKN45 cells(P<0.05). A positive response correlation could be found between the expression of EGFR mRNA and RAS mRNA(r=0.870). There was negative response correlation between the inhibitive effect and the expression of EGFR mRNA (r=-0.956，n=12) .There was negative response correlation between the inhibitive effect and the expression of RAS mRNA(r=-0.923，n=12).Conclusion: 5-Furubicin combined with hypothermia shows obvious inhibitive effect to MKN45 cells ，increases the inhibition,possibly through down-regulation of EGFR and RAS .

Stomach neoplasms/physiopathology Fluorouracil/drug effects Diathermy Apoptosis Releptor,epidermal growth factor

胃肿瘤/病理生理学 氟尿嘧啶/药物作用 透热疗法 细胞凋亡 受体，表皮生长因子

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.03.007