新生儿先天性巨结肠活检标本中Calretinin的诊断作用

赵 丽，赵林胜，赵绪稳，张爱华，胡晓丽

新生儿先天性巨结肠活检标本中Calretinin的诊断作用

赵 丽1，赵林胜1，赵绪稳2，张爱华1，胡晓丽1

目的探讨 Calretinin在新生儿先天性巨结肠（hirschsprung disease，HD）活检标本中诊断的作用，为 HD的早期准确诊断提供有益的帮助。方法收集疑似 HD患儿首次行肠黏膜活检标本51例，分别行常规 HE及免疫组化 EnVision法染色，判读黏膜下层有无神经节细胞，并对 Calretinin的染色特点、分布情况进行观察。结果51例活检标本中，镜下见神经节细胞，同时 Calretinin染色阳性者 8例，排除HD诊断。HE染色未见神经节细胞，同时Calretinin染色阴性者39例，后经手术证实均为HD。剩余4例，其中2例 HE染色未见神经节细胞，但 Calretinin染色阳性，亦排除 HD的诊断；另2例因黏膜下层组织稀少，未见Calretinin染色阳性的神经节细胞，但黏膜固有层内可见 Calretinin染色阳性的神经纤维，再次活检证实有神经节细胞。结论新生儿及小婴儿由于神经节细胞发育不成熟，HE染色不易观察。因此，免疫组化标记 Calretinin的表达对新生儿HD诊断具有重要的辅助作用。

先天性巨结肠；Calretinin；免疫组织化学

先天性巨结肠（hirschsprung disease，HD）是胚胎时期神经脊的神经母细胞迁移障碍导致的先天性消化道畸形，其病理特点是病变肠管的黏膜下及肌间神经丛中神经节细胞缺如，常伴异常增生的胆碱能神经纤维，最常累及直肠、乙状结肠，也可累及全结肠，偶可累及小肠［1］。直肠黏膜活检是诊断 HD的金标准，然而实际工作中，病理医师在小的活检标本中判断是否存在神经节细胞是非常困难的［2］。因此寻找更为特异、灵敏的抗体来辨别神经节细胞是当前研究的热点。Calretinin属于重要的钙结合蛋白，在中枢及周围神经系统中发挥重要的作用。文献报道［3－5］，免疫组化标记Calretinin染色结果读取直观，对病理医师经验度依赖不高：即在肠壁黏膜固有层、黏膜下层或肌间有 Calretinin染色阳性的神经节细胞或神经纤维即可排除HD的诊断，反之 Calretinin表达缺失则支持HD诊断。本文着重探讨免疫组化标记Calretinin染色在新生儿及小婴儿肠活检标本中的诊断作用，旨在为 HD的早期诊断提供有益的帮助。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2013年1月 ～2015年12月天津市儿童医院疑似 HD患儿首次行肠黏膜活检的标本 51例，其中男婴36例，女婴15例；患儿年龄均≤3个月，其中年龄最小者1天，最大者3个月，平均 43天。患儿临床症状：24 h内无胎便排出、胎便排出延迟、腹胀、呕吐、便秘、肠穿孔、小肠结肠炎等。

1.2 方法所有组织均为直肠黏膜活检标本，取材部位在齿状线上3 cm。标本均经 10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片约 50张，常规HE染色及免疫组化 EnVision法染色，一抗购自上海长岛公司，二抗及 Ventana全自动免疫组化仪购自罗氏公司，用 PBS代替一抗作阴性对照，阑尾组织作阳性对照。由两位高年资病理医师采用双盲法对51例活检标本的HE切片进行阅片，显微镜下寻找神经节细胞；并对免疫组化标记Calretinin的表达进行判断。

1.3 结果判断常规 HE染色在黏膜下层查见神经节细胞即排除 HD诊断；在黏膜固有层或黏膜下层查见 Calretinin染色阳性的神经纤维或神经节细胞亦排除 HD诊断。

1.4 统计学分析所有数据均采用 SPSS 20.0软件进行统计学处理，两组间率的比较采用 χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 HE染色51例活检标本中，HE染色查见神经节细胞8例（图1），39例未查见神经节细胞；2例黏膜下层组织稀少未查见神经节细胞，建议再次行活检；2例黏膜下层内未见典型的神经节细胞（图2），建议再次活检或免疫组化染色证实。

2.2 免疫组化染色Calretinin表达于神经节细胞（包括不成熟神经节细胞）的胞质及胞核（图 3、4），黏膜固有层及黏膜下层神经纤维亦呈阳性。51例活检标本中 Calretinin染色阳性者10例，Calretinin染色阴性者39例（图5）；其中39例Calretinin阴性者后经手术证实均为 HD。2例直肠活检标本由于黏膜下层组织少，未查见 Calretinin染色阳性的神经节细胞，但黏膜固有层内见染色阳性的神经纤维（图6），遂再次活检在黏膜下层内查见神经节细胞，排除 HD。

图1 HE染色可见神经节细胞 图2 HE染色未见神经丛及典型的神经节细胞 图3 Calretinin在神经节细胞及神经纤维中呈阳性，EnVision法 图4 Calretinin在不典型的神经节细胞中呈阳性（与图2为同一张切片的同一部位），EnVision法 图5 HD中未见Calretinin阳性的神经节细胞及神经纤维，EnVision法 图6 非 HD中黏膜固有层可见Calretinin阳性的神经纤维，EnVision法

2.3 两种染色的相关性分析HE染色查见神经节细胞排除 HD诊断合计8例（8／51）；Calretinin染色查见神经节细胞或神经纤维排除 HD诊断合计 12例（12／51）。校正后 χ2值为26.00，P＜0.01为差异有统计学意义。结果显示免疫组化标记 Calretinin更有助于 HD诊断。

3 讨论

HD是儿科常见的疾病，活产儿发生率为 1／5 000，遗传特性复杂［6］，男女比为 4∶1。理论上 HE染色未查见神经节细胞同时伴异常增生的粗大神经丛即可诊断 HD。对于手术根治的肠管标本诊断较易，但对于术前肠黏膜活检标本［7］，特别是月龄小于 3个月的新生儿及小婴儿诊断较为困难。原因如下：（1）新生儿及小婴儿肠壁薄弱，为防止肠穿孔的发生，临床医师取活检时会十分小心，标本往往小而且薄，黏膜下层标本取材不足（未达黏膜下Meissner神经丛）［8］；（2）新生儿及小婴儿肠壁内常见发育不成熟的神经节细胞，如果病理医师经验不足，可能会遗漏；（3）与年龄较大的婴儿相比，新生儿及小婴儿黏膜下层的神经节细胞较为稀疏，所以不易观察［9］。虽然 HE染色仍是诊断HD的标准方法，但是对于上述这些问题，仅仅依靠 HE染色诊断 HD可能会导致误、漏诊。

乙酰胆碱酯酶（AchE）染色和免疫组化染色常被用于HD的辅助诊断，但均有一定的局限性。如AchE染色需要冷冻切片，结果的判定具有很强的主观性，且灵敏度不高，特别是在新生儿及婴儿中，其敏感性分别为 40.0%和 88.8%［10］。Calretrinin是一种 Vitamin D依赖的钙结合蛋白，相对分子质量为 2.9×104，主要表达在中枢和周围神经系统中，是神经细胞内重要的活性物质，可缓冲胞质内钙离子的浓度，具有神经保护作用。2004年Barshack等首次提出 Calretinin仅在HD肠切除标本的有神经节细胞段表达，而在无神经节细胞段表达缺失。2011年 Hiradfar等对肠壁全层的Calretinin染色结果进行分析，发现各种类型 HD痉挛段固有层、黏膜肌层、黏膜下层、肌层 Calretinin染色均阴性，而有神经节细胞段及非 HD患儿肠壁各层 Calretinin染色均阳性，该研究证实Calretinin对诊断 HD具有很高的灵敏度及特异性［11］。此外Kapur等［9］证实在肠活检标本中通过免疫组化标记 Calretinin诊断 HD要优于 AchE染色，且操作简便结果直观易于读取。因此，Calretinin在诊断或排除 HD诊断时具有其他抗体不能比拟的优势，特别是对于肠黏膜活检标本。

有学者认为，如果想要得到确切的诊断结果，活检标本一般至少需要 2块，每一块的直径≥3 mm，且要有足够的黏膜下层。一些研究指出，9%～17%的活检标本黏膜下层不足。本组中，51例活检标本中仅有2例黏膜下层标本取材不足（2／51），发病率低于文献报道，可能与我们经常和临床医师沟通，强调活检标本大小及深度有关。对于这2例取材不足的标本，HE染色及免疫组化标记 Calretinin染色均未见神经节细胞，而固有层内可见 Calretinin染色阳性的神经纤维，经再次活检查见神经节细胞。作者认为如果黏膜下层内存在神经节细胞，则神经节细胞发出的突触可延伸至固有层内，因此对取材不足的标本，固有层内出现 Calretinin染色阳性的神经纤维，对神经节细胞的存在有提示作用。国内张文等发现非 HD肠黏膜活检标本中固有层内可见多少不等的Calretinin染色阳性纤维丝结构，密集区域染色阳性的纤维丝可形成网状模式，而 HD患者整个黏膜层 Calretinin染色阴性或仅见1～2根 Calretinin染色阳性的神经纤维，两者之间差异非常突出，接近 10倍［7］。本组中 10例有神经节细胞的活检标本中，黏膜固有层内均可见 Calretinin阳性的神经纤维，而39例无神经节细胞的病例中，固有层内除肥大细胞染色阳性且呈点状分布外，均未见 Calretinin染色阳性的神经纤维。提示在 HD的诊断中，即使取材表浅，但根据固有层内Calretinin染色阳性神经纤维的有无及数量，可以对是否存在HD做出诊断，这就对取材的要求大大降低，从而减少重复活检或进行结肠全层活检的比例，但如何进行量化判断，作者认为需要大样本的实验证实。

对于新生儿及小婴儿，肠壁内常见发育不成熟的神经节细胞，这些未成熟的神经节细胞胞体小，核小，未见核仁，几乎未见胞质，最小的仅略大于红细胞，因此 HE染色时不宜观察，特别是在活检标本中，由于组织较小黏膜下层神经节细胞稀疏，因此更容易遗漏，从而误诊为 HD。本组以≤3个月的新生儿及婴儿为分析对象，其中 2例活检标本，即便是两位高年资的儿科病理医师仅凭 HE染色也不能明确有无神经节细胞；而通过免疫组化标记Calretinin染色，在黏膜下层内可见染色阳性、未成熟的神经节细胞，避免了再次活检，给患儿减轻痛苦。国外 Melanie等［12］报道，Calretinin免疫反应最早可出现在妊娠22周的胎儿内，因此 Calretinin可用于婴儿甚至是早产儿 HD的诊断。由此可见，Calretinin在发育不成熟的神经节细胞中亦可表达，其在诊断 HD时不受患儿年龄的限制，有利于早期诊断及治疗。

此外，本组39例 HE染色阴性的病例，Calretinin染色亦阴性，但是常规 HE染色诊断 HD需要连续切片 50～75张，费时费力，且诊断医师需要有丰富的经验，如诊断者经验不足，很容易将内皮细胞、胶质细胞等与神经节细胞混淆。免疫组化标记 Calretinin结果易于读取和判断，对诊断者经验度依赖不高。Guinard等［13］报道12例 HD的病例，通过 HE 及 AchE染色均不能诊断需再次进行活检，Calretinin则均诊断正确。

越来越多的报道证实免疫组化标记 Calretinin染色在诊断 HD时优势明显，其对活检标本的要求较低，在未成熟的神经节细胞中亦呈阳性，且显色清晰，易于判读。因此，我们认为肠黏膜活检常规HE染色 ＋免疫组化标记 Calretinin染色可以作为诊断 HD的首选方法，特别是对于新生儿及婴儿患者。近期有文献报道［14］，Calretinin阳性的神经纤维可延伸至无神经节细胞肠段。因此，临床高度怀疑 HD而肠黏膜活检存在Calretinin染色阳性神经纤维时，需警惕超短段型HD可能。

［1］ Kesslnann J.Hirschsprung’s disease：diagnosis and management ［J］.Anl Faro Physician，2006，74（8）：1319－1322.

［2］ Leyla C，Bahar C，Berrin G，etal.Calretinin immunohistochemistry for the diagnosis of hirschprung disease in rectal biopsies［J］. Pathol Res Practi，2015，211（1）：50－54.

［3］ de Arruda Lourencao P L，Takegawa B K，Ortolan E V，et al.A useful panel for the diagnosisofhirschsprung disease in rectal biopsies：Calretinin immunostaining and acetylcholinesterase histochemistry［J］.Ann Diagn Pathol，2013，17（4）：352－356.

［4］ Holland SK，Ramalingam P，Podolsky R H，etal.Calretinin immunostainingas an adjunct in the diagnosis of hirschsprung disease ［J］.Ann Diagn Pathol，2011，15（5）：323－328.

［5］ Yin H，Boyd T，Pacheco M C，et al.Rectal biopsy in children with down syndrome and chronic constipation：hirschsprung’s disease vs non-hirschsprung’s disease［J］.Pediatr Dev Pathol，2012，15（2）：87－95.

［6］ Butler Tjaden N E，Trainor P A.The developmental etiology and pathogenesis of hirschsprung disease［J］.Transl Res，2013，162 （1）：1－15.

［7］ 张 文，范 丽，黄敏捷，等.钙视网膜蛋白在先天性巨结肠不同肠段的表达差异及其临床意义［J］.中华病理学杂志，2014，43（12）：831－833.

［8］ Woo IY，Jung-Tak O.Calretinin and microtubule-associated protein-2（MAP-2）immunohistochemistry in the diagnosis of Hirschsprung’s disease［J］.JPed Surg，2013，48（10）：2112－2117.

［9］ Kapur R P，Reed R C，Finn L S，et al.Calretinin immunohistochemistry versus acetylcholinesterase histochemistry in the evaluation of suction rectal biopsies for Hirschsprung disease［J］.Pediatr Dev Pathol，2009，12（1）：6－15.

［10］Bagdzevidus B，Gehnan S，Gukauskiene L，et al.Application of acetylcholinesterase istochemistry for the diagnosisof hirschsprung’s disease in neonates and infants：a twenty year experience［J］.Medicina（Kaunas），2011，47（7）：374－379.

［11］Hiradfar M，Sharifi N，Khajedaluee M，et al.Calretinin immunohistochemistcry：an aid in the diagnosis of Hirschsprungs Disease ［J］.Iran JBasic Med Sci，2012，15（5）：1053－1059.

［12］Melanie IM，Dorothée B S，Alain O，et al.A study of Calretinin in hirschsprung pathology，particularly in total colonic aganglionosis［J］.JPed Surg，2013，48（5）：1037－1043.

［13］Guinard SV，Bonnard A，De Lagausie P，et al.Calretinin immunohistochemistry：a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung’s disease［J］.Mod Pathol，2009，22（10）：1379－1384.

［14］Alexandrescu S，Rosenberg H，Tatevian N.Role of Calretinin immunohistochemical stain in evaluation of Hirschsprung disease：an institutional experience［J］.Int JClin Exp Pathol，2013，6（12）：2955－2961.

R 365

：B

1001－7399（2017）01－0096－03

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.025

接受日期：2016－11－15

天津市儿童医院1病理科、2新生儿外科 300134

赵 丽，女，硕士，主治医师。Tel：（022）87787210，E-mail：719688832＠qq.com

胡晓丽，女，主任医师，通讯作者。Tel：（022）87787208，E-mail：huxiaoli788＠126.com