子宫颈癌中高危型HPV感染与c-jun和c-fos蛋白表达的关系

朱皓皞，任光玉，吴 琴，熊敦勇，袁 婷，余晚霞

子宫颈癌中高危型HPV感染与c-jun和c-fos蛋白表达的关系

朱皓皞，任光玉，吴 琴，熊敦勇，袁 婷，余晚霞

目的探讨子宫颈癌中高危型人乳头状瘤病毒（high-risk human papilloma virus，HR-HPV）感染与 c-jun和 c-fos蛋白表达的关系及临床意义。方法采用 Cervista技术对70例子宫颈鳞状细胞癌（cervical squmaous cell carcinoma，CSCC）、60例子宫颈上皮内病变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）及20例慢性子宫颈炎行 HR-HPV检测，同时应用免疫组化 SP法检测AP-1通路重要组份c-jun和c-fos蛋白的表达，分析HR-HPV感染与c-jun和c-fos蛋白表达的相关性及与子宫颈癌临床病理特征的关系。结果70例CSCC中69例 HR-HPV呈阳性，阳性率98.6%（69／70），其中 A9组阳性占比最高，达85.5%（59／69）。70例CSCC中c-jun和c-fos的阳性率分别为80%（56／70）、85.7%（60／70），30例 CIN2＋CIN3中的阳性率均为70%（21／30），30 例CIN1中的阳性率分别为20%（6／30）、23.3%（7／30），20例慢性子宫颈炎中的阳性率均为0。CSCC组与 CIN组及慢性子宫颈炎组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。c-jun、c-fos阳性率在CSCC的临床分期、组织学分级等分组中差异有统计学意义（P＜0.05）；CSCC中HR-HPV阳性与c-jun、c-fos的表达均呈正相关（P＜0.01）。结论 CSCC中HR-HPV感染具有显著的亚型特点，且与c-jun和c-fos表达呈正相关，提示HR-HPV感染后AP-1通路活化可能与肿瘤的发生、发展相关。

子宫颈肿瘤；人乳头状瘤病毒；c-jun；c-fos；病理学

子宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，近年来发病率逐年上升且呈年轻化趋势，严重威胁女性身体健康［1］。现已证实其发生与高危型人乳头状瘤病毒（high-risk human papilloma virus，HR-HPV）感染密切相关，HR-HPV持续感染是子宫颈癌的发病诱因，其是子宫颈癌发生的必要生物学条件［2］。有文献报道并非所有感染 HPV病毒的个体均进展为癌，因此 HPV感染和子宫颈癌发生的内在机制尚不明确。本文应用新型 Cervista技术和免疫组化 SP法检测70例子宫颈鳞状细胞癌（cervical squmaous cell carcinoma，CSCC）患者的子宫颈分泌物 HR-HPV感染情况及术后肿瘤组织中 AP-1信号通路中的重要分子 c-jun和 c-fos的表达，并结合临床病理资料分析HR-HPV感染情况与c-jun和 c-fos蛋白表达的相关性，探讨 HR-HPV感染与AP-1信号通路活化是否参与子宫颈癌的发生、发展及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2013年3月～2016年2月解放军第九四医院病理科确诊的 70例CSCC患者子宫颈分泌物、手术标本蜡块，根据组织学分化程度分为3级：其中 1级高分化癌 25例，2级中分化癌 35例，3级低分化癌10例。患者年龄 32～72岁，平均48.3岁。按FIGO（2009）临床分期标准：Ⅰ＋Ⅱ期者30例，Ⅲ＋Ⅳ期者 40例；伴盆腔淋巴结转移者27例，无淋巴结转移者 43例；另选 30例低度鳞状子宫颈上皮内病变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）即 CIN1级，30例高度鳞状上皮内病变即CIN2 ＋CIN3级，20例慢性子宫颈炎作为对照组。所有患者术前均未行放、化疗或激素治疗，均有完整的临床及随访资料。所有标本均采用 10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片。HE石蜡切片由两名副高级以上病理医师复阅诊断。

1．2 HR-HPV检测采用美国豪洛杰（Hologic）公司的新型 Cervista技术，按构型采用 3组寡核苷酸混合物分别行14种HR-HPV检测，其中A5／6组检测51、56、66型，A7组检测18、39、45、59、68型，A9组检测16、31、33、35、52、58型。DNA样本提取及检测参照试剂盒说明书进行操作，所有样本均设阴、阳性对照，任意一组或几组阳性者判读为 HR-HPV阳性。

1.3 免疫组化鼠抗人c-jun和 c-fos单克隆抗体和二抗试剂盒均为即用型，购自福州迈新公司。抗原修复采用柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）高压修复。免疫组化染色采用SP法，具体操作步骤按试剂盒说明书进行，以 PBS代替一抗做阴性对照，已知阳性结果做阳性对照。结果判断：c-jun和 c-fos蛋白免疫组化结果以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性。由两名副高级以上病理医师对切片进行双盲法阅片，每张切片随机选取 10个高倍视野（×400），根据染色细胞百分率和染色程度进行综合评分。阳性细胞所占百分比分为5级：无阳性着色细胞为0分，阳性着色细胞1%～25%为1分，阳性着色细胞26%～50%为2分，阳性着色细胞51%～75%为3分，阳性着色细胞 76%～100%为4分；根据细胞染色强度分为4级：无阳性着色为 0分，浅黄色为 1分，棕黄色为2分，棕褐色为 3分。阳性细胞百分比和染色强度乘积为免疫反应得分（immunoreactive score，IRS）［3］，即IRS＝阳性细胞百分比／级 ×染色强度／级。按照0～2分为（－），3～5分为（＋），6～8分为（⧺），9～12分为（⧻）；其中0～2分判为阴性，3 ～12分判为阳性。

1.4 统计学方法采用 SPSS 17.0软件对各数据进行统计学处理。计数资料用率或百分比表示，率的比较采用χ2检验（或Fisher确切概率法），相关性采用 Spearman等级相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 不同子宫颈病变中 HR-HPV感染情况70 例 CSCC患者中 HR-HPV检测69例呈阳性，阳性率98.6%（69／70），其中 A9组阳性占比最高，达85.5%（59／69）。CIN2＋CIN3级患者HR-HPV感染率96.7%（29／30），其中 A9组占比 86.2%（25／29）。CIN1级患者 HR-HPV感染率66.7%（20／30），其中A9组占比55%（11／20）。对照组慢性子宫颈炎 HR-HPV感染率仅 5%（1／20），为 A5／6型组（表1）。

表1 不同子宫颈病变中 HR-HPV感染情况

2．2 c-jun、c-fos表达及与 CSCC的临床病理特征关系c-jun和 c-fos阳性表达定位于细胞核，慢性子宫颈炎中未见阳性细胞，CIN组中可见阳性细胞上移，位置与级别相符。CSCC组中阳性细胞明显增多且呈强阳性。CSCC、CIN2＋CIN3组与慢性子宫颈炎组及 CIN1组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），但在 CSCC与 CIN2＋CIN3、CIN1与慢性子宫颈炎组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05，表2、3，图1～4）。70例 CSCC组织中 c-jun蛋白表达与肿瘤FIGO分期、组织学分级及盆腔淋巴结转移等分组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；与患者年龄、肿瘤大小等分组中的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。c-fos蛋白表达与肿瘤 FIGO分期、组织学分级相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；与患者年龄及肿瘤大小及盆腔淋巴结转移等分组中表达差异无统计学意义（P＞0.05，表4）。

图1 c-jun在CSCC中呈阳性，SP法 图2 c-jun在CIN3中呈阳性，SP法 图3 c-fos在CSCC中呈阳性，SP法 图4 c-fos在CIN3中呈阳性，SP法

表2 c-jun在不同子宫颈组织中的表达

表3 c-fos在不同子宫颈组织中的表达

表4 c-jun、c-fos表达与 CSCC临床病理特征的关系

2．3 HR-HPV阳性与c-jun、c-fos在CSCC中表达的相关性Spearman等级相关分析显示：HR-HPV阳性在CSCC组织中与c-jun、c-fos表达呈显著正相关（P＜0.01，表5）。

表5 CSCC中HR-HPV与c-jun、c-fos表达相关性分析

3 讨论

自20世纪70年代后期Harald zur Hausen博士提出 HPV与子宫颈癌有关以来，近 40余年大量流行病学研究已证实子宫颈癌及癌前病变的发生与HR-HPV持续感染和缺乏子宫颈癌筛查有关。乳头状瘤病毒的种系分类包括118型，HPV为 A属由许多密切相关的亚型组成，其中最重要的是 A9分化体（以HPV 16为代表）和A7分化体（以HPV 18和HPV 45为代表）［3］。大多数HPV感染为一过性，并可被机体免疫反应清除，HR-HPV感染清除时间比低危者缓慢，若感染持续时间 36个月后，将来被清除的可能性则显著降低；且持续感染时间越长，更可能形成高度病变，甚至发展成浸润性子宫颈癌［4］。因此，HR-HPV持续感染在大多数子宫颈癌及其前驱病变的发病机制上起关键作用。本实验发现，在70例 CSCC患者子宫颈分泌物中HR-HPV的阳性率98.6%，在 CIN2＋CIN3级中同样有类似的高阳性率，且均以A9组占比最多，提示 A9组HPV在人类具有高致病性、易感性的生物学特性。这一实验结果与现有报道相同，国内李芳等［5］通过对 21 776例女性进行HPV感染的回顾性分析发现，在 4 274例感染标本中 A9组检出率最高（2 237例），占比10.3%，且 A9组HPV感染患者在随后的子宫颈活检中诊断为CIN2＋CIN3级的比率高达70.3%，提示HR-HPV A9组病毒致病性及导致子宫颈癌的危险程度最高。临床应对 A9组 HR-HPV感染患者采取更积极的治疗及随访策略。

AP-1信号通路是近年来倍受关注的细胞中重要的信号转导通路，研究表明［6］，AP-1信号通路活化与肿瘤的发生、发展密切相关，在参与肿瘤发生和进展的基因序列上，常能检测到AP-1结合位点的存在，其活性增高可诱导恶性肿瘤的形成，并促进肿瘤组织浸润及转移能力增强。原癌基因 c-jun和 c-fos属于 myc基因家族，其蛋白表达产物 c-jun和c-fos定位于细胞核，具有结合特异性DNA序列和激活基因转录的活性，是一种早期基因编码的核转录因子。AP-1通常由 c-jun和 c-fos以亮氨酸拉链结构域的异源二聚体结构，两者均可因结构改变而被激活为癌基因，通过MAPKS家族的磷酸化来调节激活前和新合成的AP-1活性，其产物可结合到多种基因增强子上，导致靶基因的表达而引起致癌作用［7］。在体细胞受各种刺激如病毒感染后，体内c-jun和 cfos蛋白水平增高，激活AP-1信号通路，并通过调控下游靶基因促进肿瘤新生血管的形成、肿瘤细胞运动、黏附增加等促进恶性肿瘤侵袭转移能力增强。同样，在人类鳞状细胞癌组织中，也观察到高水平的c-jun和c-fos蛋白，且较高的 c-jun和 c-fos蛋白水平均能增加淋巴结癌转移机率，其机制可能与诱导AP-1活性的正反馈循环有关。

本实验从慢性子宫颈炎、CIN1、CIN2＋CIN3、CSCC疾病谱中检测 c-jun和 c-fos蛋白的表达，cjun和 c-fos蛋白在慢性子宫颈炎中均呈阴性，在CSCC及其癌前病变中呈高表达，且在CSCC中的表达随肿瘤组织分化程度的降低及临床分期升高。其阳性率逐渐增高、强度逐渐增强，组间差异有统计学意义（P＜0.05），证实 AP-1通路活化与子宫颈疾病的发生、发展密切相关。本组前期实验已证实c-jun 和 c-fos蛋白具有协同作用［8］，这一结果与 Prusty等［9］的报道相符，c-jun和 c-fos表达强度随 CIN级别增高其强度逐步增强，在 CSCC中均呈强表达。由于恶性肿瘤的发生是一个多步骤、多基因改变的过程，且 CIN及 CSCC均为 HPV感染相关性疾病。因此，在该瘤变进程中病毒感染后AP-1转录因子可能起重要的促进作用。此外，本实验结果还显示HR-HPV感染与c-jun和c-fos在 CSCC中的表达呈正相关，提示AP-1信号通路活化可能是 HPV感染后子宫颈癌发生、发展的重要步骤。这也与文献报道［10－11］相一致。Chen等［12］采用 mRNA原位杂交法检测湿疣患者中 E5Aa基因和 c-jun mRNA的表达情况，发现c-jun mRNA水平在E5AamRNA水平高的子宫颈湿疣标本中比在正常子宫颈标本高，并认为HPV感染可能促进c-jun mRNA的转录。HPV感染后可通过c-jun、c-fos表达促进细胞增生，但其确切机制有待进一步分析。

综上所述，HR-HPV阳性与 c-jun和 c-fos蛋白表达呈正相关，提示 HR-HPV感染后 AP-1通路活化在 CSCC的发生、发展中可能发挥重要作用，联合检测 HR-HPV与c-jun和 c-fos蛋白的表达，有助于临床对子宫颈疾病的早期筛查、准确分级及预后评估，提高子宫颈疾病的整体治疗水平，并有望通过下调 c-jun和 c-fos水平来逆转 AP-1活性成为子宫颈癌治疗的新手段。

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Relationship of high-risk human papillomavirus infection and c-jun and c-fos expression in cervical carcinoma

ZHU Hao-hao，REN Guang-yu，WU Qin，XIONG Dun-yong，YUAN Ting，YUWan-xia
（Department of Pathology，the94th Hospital of PLA，Nanchang 330002，China）

PurposeTo investigate the relationship and clinical significance of high-risk human papillomavirus infection and expression of c-jun and c-fos protein in cervical carcinoma.M ethodsCervista HR-HPV testing，immunohistochemical SP method were employed to detect the infection of HR-HPV，c-jun and c-fos protein in 70 cases of CSCC，60 cases of cervical intraepithelial neoplasia and 20 cases of chronic cervicitis.The correlation between c-jun and c-fos protein expression and of HR-HPV infection was analyzed.ResultsOf the 70 cases of CSCC，the positive HR-HPV was 69 cases，the positive rate in HR-HPV in A9 group was the highest（85%，59／69）.The positive expression of c-jun and c-fos were 80% （56／70），85.7% （60／70）in 70 cases CSCC，70% （21／30）and 70% （21／30）in 30 cases of cervical high grade intraepithelial neoplasia，and 20%（6／30），23.3%（7／30）in 30 cases cervical low grade intraepithelial neoplasia，but the positive expression rates of c-jun and c-fos in the 20 cases of chronic cervicitiswere 0.Expression of c-jun and c-fos in cervical cancer group was higher than that in the chronic cervicitis group and low grade intraepithelial neoplasia（P＜0.05）.The expression of c-jun and c-fos was statistically significant in different groups of clinical stage and pathologic grading in the CSCC（P＜0.05）.Additionally，the expression of c-jun and c-fos was positively correlated with the infection of HR-HPV in CSCC（P＜0.01）.ConclusionThe infection of HR-HPV has significant subtype-specific and has a positive correlation with the expression of c-jun and c-fos in CSCC，which suggests that AP-1 pathway activation after HRHPV infection may be associated with the occurrence and development of cervical carcinoma.

cervical neoplasm；HPV；c-jun；c-fos；pathology

R 737.33

：A

1001－7399（2017）01－0027－05

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.007

接受日期：2016－11－21

南京军区医药卫生资助（12MB022）

江西南昌解放军第九四医院病理科，南昌 330002

朱皓皞，女，副主任医师。E-mail：2572839187＠qq.com