丁 莉,邹先进,范婉婷,郑 杰,陈 琼
应用时间分辨法检测石蜡包埋子宫颈组织p16INK4a蛋白
丁 莉1,邹先进1,范婉婷1,郑 杰1,陈 琼2
目的探讨时间荧光分辨法(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)检测子宫颈组织中 p16INK4a蛋白的表达。方法选
子宫颈组织;p16INK4a;免疫组织化学;时间荧光分辨法
p16INK4a基因在乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和恶性黑色素瘤等许多肿瘤中,易出现缺失、突变或表观沉默,其表达减少并失去生长抑制作用[1]。在子宫颈癌及癌前病变中,人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)持续感染并与宿主细胞整合产生E6/7原癌基因蛋白,打断 pRb-E2F-p16INK4a负反馈通路,导致 p16INK4a功能失活在细胞中蓄积增多。子宫颈癌及子宫颈鳞状上皮内病变中 p16INK4a表达均升高,免疫组化 EnVision两步法检测子宫颈组织、子宫颈脱落细胞中 p16INK4a蛋白,用于辅助诊断子宫颈肿瘤性病变,得到众多学者的共识[2-5],p16INK4a是具有发展前景的子宫颈癌标志物。时间荧光分辨法(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)检测蛋白表达线性范围广、非特异性信号低,其标志物制备简便、保存时间长、无放射性污染,被临床广泛应用。本实验建立 TRFIA法检测子宫颈组织中p16INK4a蛋白表达,并与免疫组化 EnVision两步法进行相关性分析,为p16INK4a蛋白应用于临床检测工作提供依据。
1.1 标本选取2013年6月 ~2015年6月荆门市第一人民医院存档的子宫颈小活检标本 126例,患者年龄21~75岁,均已婚且无子宫颈手术史。免疫组化染色切片同时切取子宫颈组织薄片收集于 EP管中用于 TRFIA法检测。
1.2 仪器与试剂免疫组化p16INK4a抗体购自福州迈新公司,子宫颈石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒购自上海生工公司,TRFIA检测 p16INK4a抗体购自 Abnova公司。半自动 VICTOR 1420多标记检测仪购自 Perkin Elmer公司。
1.3 免疫组化检测子宫颈组织中 p16INK4a蛋白所有标本均经 10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,切片,HE染色。免疫组化采用 EnVision两步法,3 mm厚切片,EDTA抗原修复液高压修复,DAB显色。
1.4 TRFIA检测子宫颈组织中 p16INK4a蛋白(1)组织蛋白提取:切取 6片 5μm厚石蜡包埋组织置于1.5 mL EP管中,加入1 mL预处理试剂 A,高速涡悬震荡30 s后室温静置 5 min,并颠倒离心管数次。加入100μL预处理试剂B,涡悬震荡10 s后离心10 000 r/min×2min,移去上下两层液体。用500 μL双蒸水清洗脱蜡的组织 2次,加入 100μL提取试剂,涡悬震荡数秒,置于金属浴中 100℃处理20 min,然后调节金属浴至60℃处理2 h,约20 min震荡1次。4℃离心12 000 r/min×15 min,取上清至洁净EP管中置于-20℃备用。(2)包被:以多克隆抗体包被进口雷勃板,室温慢速震荡 1 h,4℃静置20 h后以每孔300μL PBS洗板2次并拍干,每孔加入200μL封闭液(PBS配制2%BSA)于37℃静置2 h,拍干并密封-20℃保存备用。(3)标记:将单克隆抗体加入超滤管中离心 10 000 r/min×10 min,将浓缩后的抗体加入 200μL标记缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 9.0)中离心10 000 r/min×10 min,弃滤液;重复5~6次。将几次离心后的超滤管取出弃滤液,把离心管滤膜反转,4 000 r/min×3 min离心收集滤液。再次将滤膜反转,加入 100μL标记缓冲液静置 5 min,将滤膜重新反转,5 000 r/min×2 min离心收集液体。按摩尔比(5∶1)加入Eu-DTTA充分混匀后于室温震荡孵育 16~20 h,过凝胶层析柱纯化,对标记样品进行上样洗脱。待蛋白检测仪显示出现蛋白峰时,开始收集样品(每管1 mL)。取5μL收集样品,加至空白孔中,每孔加200 μL增强液,室温缓慢震荡5 min,测荧光值,收集信号最高的几管合并,加终浓度为0.1%去金属离子的 BSA,小量分装备用。(4)p16INK4a蛋白检测:稀释样品,用生理盐水将待测样品1∶100稀释,按每孔100μL加入稀释后的样品,封板于37℃震荡孵育1 h,每孔300μL洗板4次并拍干。每孔加入100μL铕标记抗体1∶100(分析缓冲液稀释)并封固于室温震荡孵育2 h。洗板 6次并拍干,加入每孔 200 μL增强液,室温慢速振摇5 min,检测荧光值。每个样本设2个重复孔,应用免疫组化检测 p16INK4a蛋白强阳性的 HSIL样本为阳性对照、p16INK4a蛋白阴性的未见上皮内病变细胞及恶性细胞、生理盐水为阴性对照。
1.5 结果判读子宫颈组织学活检结果判读为未见上皮内病变细胞及恶性细胞、低级别鳞状上皮内病 变 (low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)、高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)和子宫颈鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)。
免疫组化检测子宫颈组织 p16INK4a蛋白:细胞核和(或)细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性,阳性强度根据阳性细胞占肿瘤细胞比例及染色深浅判断。按阳性细胞百分比计分:不着色或阳性细胞数 <5%为0分,5%~25%为1分,26%~50%为2分,>50% 为3分;按染色强度计分:黄色为 1分,棕黄色为 2分,棕褐色为3分。两项指标相乘:0~1分为阴性(-),2~3分为弱阳性(+),4~6分为中阳性(⧺),>6分为强阳性(⧻)。
TRFIA检测子宫颈组织 p16INK4a蛋白:统计学中,当数据处于正态分布时,个体样本的测量值与平均值之差落在 3倍标准差之内的可信限为 99%。本实验选取的所有免疫组化结果阴性未见上皮内病变细胞及恶性细胞病例平均荧光值记为 MOD,标准差记为SD,检测样本个体荧光值记为ODi,以ODi<MOD+3SD判读为阴性(-),ODi≥MOD+3SD判读为阳性(+)。
1.6 统计学处理采用 SPSS 17.0软件进行统计学分析,χ2检验法进行率的比较,以 P<0.05为差异有显著性。
2.1 病理组织学检查126例活检样本中,未见上皮内病变细胞及恶性细胞标本 20例,LSIL标本 24例,HSIL标本53例,SCC标本29例。
2.2 免疫组化检测子宫颈活检组织中 p16INK4a蛋白表达应用免疫组化 EnVision两步法检测 p16INK4a蛋白:20例未见上皮内病变细胞及恶性细胞中p16INK4a蛋白呈弱阳性 1例,阴性 19例;24例LSIL 中 p16INK4a蛋白呈阴性5例,弱阳性 11例,中等阳性+强阳性 8例;53例 HSIL中 p16INK4a蛋白呈弱阳性6例、中等阳性及强阳性 47例,未出现阴性病例。29例子宫颈癌中,p16INK4a蛋白阴性 1例,弱阳性 5例,中等阳性+强阳性23例(表1,图1~4)。
图 1 在未见上皮内病变细胞及恶性细胞中 p16INK4a蛋白呈阴性,EnVision两步法 图 2 在 LSIL中 p16INK4a蛋白呈弱阳性,EnVision两步法 图3 在 HSIL中 p16INK4a蛋白呈强阳性,EnVision两步法 图 4 在 SCC中 p16INK4a蛋白呈强阳性,EnVision两步法
2.3 TRFIA检测子宫颈组织 p16INK4a蛋白表达与免疫组化结果分析20例未见上皮内病变细胞及恶性细胞标本中,TRFIA检测 p16INK4a蛋白阳性 3例,其中1例为免疫组化阳性。另 2例虽然免疫组化结果判读为阴性,但活检组织面积较大,TRFIA检测 p16INK4a水平在阳性阈值之上。TRFIA检测LSIL 组 p16INK4a蛋白阳性 17例,HSIL及 SCC组中阳性分别为50、27例。LSIL、HSIL及SCC组中TRFIA检测p16INK4a蛋白阳性的病例,免疫组化检测均为阳性。免疫组化结果判读为阳性而TRFIA检测阴性的病例,在LSIL、HSIL、SCC组中分别为2、3、1例(表2)。
表 1 免疫组化检测子宫颈组织 p16INK4a蛋白的表达
表 2 TRFIA检测 p16INK4a蛋白表达与免疫组化结果比较
TRFIA检测 LSIL组织中 p16INK4a蛋白阳性率为70.83%(17/24),检测HSIL及 SCC两组的总阳性率为93.90%(77/82),差异有显著性(χ2=9.842,P =0.002)。TRFIA检查子宫颈组织 p16INK4a蛋白在未见上皮内病变细胞及恶性细胞组中的阳性率为15.00%(3/20),低于 LSIL(χ2=13.716,P<0.001)、HSIL及SCC组(χ2=59.171,P<0.001)。
p16INK4a是子宫颈癌及鳞状上皮内病变较特异性的分子标志物,在多数子宫颈SCC和癌前病变中呈过表达或高表达,而在正常组织中不表达或低表达[4]。不同形态的子宫颈腺癌,包括子宫颈型、浆液型、子宫 内 膜 样 型 等,p16INK4a蛋 白 均过表 达[6]。2005~2010年中国7个地区9个医院的169例根治子宫颈腺癌标本中,免疫组化检测大部分 p16INK4a过表 达[7]。
p16INK4a蛋白检测方法有多种,免疫组化法因其检测结果直观、无需特殊条件,应用最为广泛;但该方法程序繁多、耗时较长,大部分基层医院仍然保持手工操作,因此不适合大规模检测。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)法用于检测子宫颈脱落细胞中p16INK4a蛋白,比细胞形态学筛查具有更高的敏感性和相似的特异性[8],但试剂及荧光检测系统成本高昂,并需要专业培训的病理学医师,且与免疫组化染色相比并无明显的优越性。电压免疫传感器法通过抗体吸附蛋白,引起传感器谐振频率改变反映 p16INK4a蛋白的数量[9],该方法客观、快速且技术成本较小,但稳定性和精密度有待提高。枸橼酸钠还原法制备13 nm金颗粒,建立基于免标记纳米金和抗重组 p16INK4a适配体,可用于快速检 测 p16INK4a蛋白[10]。
酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosor-bent assay,ELISA)检测子宫颈脱落细胞 p16INK4a蛋白,具有快速、成本低廉的优点,且量化的数值能够使检测更加客观,减少主观判读引起的偏差[11-12]。ELISA是将抗原及抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合,利用呈色反应进行定量分析,但是酶标志物的稳定性较差,对检测结果可能产生一定影响。
TRFIA分析法采用具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物,是目前最灵敏的微量分析技术。镧系元素标志物克服了酶稳定性差的缺点,只要反应板的液体不挥发,反应终止后测定值能稳定较长时间。镧系离子螯合物的荧光衰变时间极长,是传统荧光的103~106倍,通过时间延迟,待激发光衰减后进行发射荧光检测。由于标记离子的荧光激发光波长范围较宽,而发射光谱峰范围较窄,激发光与发射光之间的波长位移大,可达 290 nm,通过滤光片几乎可以消除背景荧光的干扰。通过时间延迟和波长分辨,将强特异性荧光和背景荧光分辨开,极大提高该方法的特异性。TRFIA检测在临床上广泛应用于病原微生物血清标志物、肿瘤标志物、激素含量检测等,并发展为新生儿筛查质控中心推荐的先天性甲状腺功能减退首选方法[13]。
本实验检测 20例子宫颈未见上皮内病变细胞及恶性细胞中p16INK4a蛋白表达,免疫组化染色显示阴性15例,TRFIA检测亦阴性;1例鳞状上皮化生阳性,TRFIA检测阳性;另外4例虽然免疫组化染色鳞状上皮部分区域散在细胞着色[14],免疫组化结果判读时依据阳性细胞比例,未参考病灶大小,因此仍然被判读为阴性。若取材面积较大时,p16INK4a蛋白总量高于 TRFIA判读阈值。TRFIA检测4例子宫颈未见上皮内病变细胞及恶性细胞,结果显示阴阳性各2例。
LSIL、HSIL及 SCC组中,TRFIA检测阳性的病例,免疫组化染色也显示阳性。免疫组化检测结果仅仅对肿瘤细胞比例进行计算,未考虑病灶大小,因此在部分病例病灶面积较小、染色较弱的情况下,p16INK4a蛋白总水平低于阳性判读阈值。SCC组中1例经免疫组化及TRFIA检测均阴性,提示 p16INK4a蛋白可阴性[15]。
免疫组化检测未见上皮内病变细胞及恶性细胞阳性1例,TRFIA检测阳性3例;免疫组化检测LSIL阳性19例,TRFIA检测阳性17例;免疫组化检测HSIL阳性53例,TRFIA检测阳性50例。少数病例因组织中病灶大小、表达 p16INK4a蛋白强度差异等因素影响,绝大部分病例中,TRFIA检测子宫颈组织p16INK4a蛋白表达与免疫组化保持一致,提示 TRFIA适合于检测子宫颈组织 p16INK4a蛋白。
TRFIA检测 p16INK4a在子宫颈组织未见上皮内病变细胞及恶性细胞组的阳性率为 15.00%(3/20),而在 LSIL阳性率为70.83%(17/24),差异有显著性(χ2=13.716,P<0.001)。TRFIA检测子宫颈组织 p16INK4a在 HSIL及SCC组的总阳 性率为93.90%(77/82),高于 LSIL组(χ2=9.842,P=0.002)。p16INK4a蛋白表达对于子宫颈病变有预测作用,强阳性患者疾病可能进展,而阴性模式仅出现在自然消退的子宫颈病变组[16]。因此若不加干预治疗,TRFIA检测 p16INK4a蛋白阳性的患者疾病可能进展,而检测阴性患者可能随着病灶面积扩大被检测出来,也可能自行消退。
本实验采用TRFIA检测石蜡包埋子宫颈组织p16INK4a蛋白,提取需进行脱蜡等一系列处理,且经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋处理可造成蛋白铰链、抗原位点折叠或断裂等,降低检测的敏感性并增加非特异性。子宫颈脱落细胞全蛋白提取则只需收集细胞、裂解并提取上清,即可进行蛋白检测。如果 TRFIA检测 p16INK4a蛋白试剂商品化,可大大降低检测成本,简化操作过程。该方法具有高灵敏度、高特异性、线性范围广、示踪物稳定、无同位素放射性污染的特点,且对检测条件要求不高,可满足基层医院到三甲医院临床不同层次的需求,有利于大规模应用。
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Detection p16INK4aprotein in cervical tissuesw ith time-resolved fluoroimmunoassay
DING Li1,ZOU Xian-jin1,FANWan-ting1,ZHENG Jie1,CHEN Qiong2
(1Department of Pathology,the First People’s Hospital of Jingmen,Jingmen 448000,China;2School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China)
PurposeTo establish a new method for detecting p16INK4ain cervical tissueswith time-resolved fluoroimmunoassay(TRFIA).M ethods126 cases of paraffin imbedding tissues of cervix were selected for immunohistochemistry(IHC)of EnVision two-step and TRFIA.ResultsThere were 20 cases of no intraepithelial lesion ormalignancy,24 cases of low-grade squamous intraepithelial lesion(LSIL),53 cases of high-grade squamous intraepithelial lesion(HSIL)and 29 cases of squamous cell carcinoma(SCC).In the groups of no intraepithelial lesion or malignancy,LSIL,HSIL and SCC,p16INK4apositive was seen in 1,19,53 and 28,respectively.TRFIA test results displayed p16INK4apositive in 3,17,50 and 27 cases,respectively.Positive of p16 using by TRFIA in no intraepithelial lesion ormalignancy,LSIL,above HSIL was 15.00%,70.83% and 93.90%,respectively(P<0.01).ConclusionTRFIA is suitable for detecting of p16INK4aprotein and demand low detection equipment.p16INK4aexpression detected by TRFIA may helpful for large scale detection in various clinical institution.
cervical tissues;p16INK4a;immunohistochemistry;time-resolved fluoroimmunoassay
R 737.33;R 446
A 文章编号:1001-7399(2017)01-0017-05
10.13315/j.cnki.cjcep.2017.01.005
接受日期:2016-11-16
湖北省自然科学基金(2013CFB478)
1荆门市第一人民医院病理科 4480002南方医科大学检验与生物技术学院,广州 510515
丁 莉,女,硕士,副主任医师。E-mail:dl789521@126. com邹先进,男,主任医师,通讯作者。E-mail:xjz6074@sina. com
取子宫颈组织病理学小活检标本126例,采用免疫组化EnVision两步法及 TRFIA法检测石蜡包埋组织中 p16INK4a蛋白。结果126例标本中,未见上皮内病变细胞及恶性细胞 20例、低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesions,LSIL)24例、高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesions,HSIL)53例、子宫颈鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)29例。免疫组化检测未见上皮内病变细胞及恶性细胞组、LSIL组、HSIL组、SCC组中p16INK4a蛋白阳性病例分别为1、19、53、28例,TRFIA检测 p16INK4a蛋白阳性病例分别为3、17、50、27例。LSIL、HSIL及 SCC组中,TRFIA检测 p16INK4a蛋白阳性的病例经免疫组化结果均为阳性。TRFIA检测p16INK4a蛋白在未见上皮内病变细胞及恶性细胞组、LSIL、HSIL及 SCC组的阳性率分别为15.00%、70.83%、93.90%,差异有显著性(P<0.01)。结论TRFIA适合于检测 p16INK4a蛋白,且对检测条件要求低,有利于临床工作中不同机构大规模检测。