高纯度EGCG单体提取与分离纯化小试工艺研究

郑琳++龚自明

摘要：在筛选出合适的富含EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯）的茶叶原料基础上，开展提取和分离纯化试验，获得配套工艺和参数，得到高纯度EGCG单体。结果显示，浸提温度70 ℃，料液比1∶20（g/mL）条件下浸提60 min，茶汤中EGCG含量较高；浸提液用聚酰胺树脂纯化分离，纯化的最佳工艺条件为上样流速1 BV/h、料液浓度为20 mg/mL、解吸流速为1 BV/h，分别用1 BV的水、1 BV 20%的乙醇溶液以及1 BV 80%的乙醇溶液进行梯度洗脱，两次柱层析制得的EGCG纯度为95.21%，得率仅为0.276%。该方法绿色无污染，对提高湖北省秋茶的利用率具有重要意义。

关键词：EGCG；提取；分离纯化；工艺研究

中图分类号：S571.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6533-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.052

EGCG（表沒食子儿茶素没食子酸酯）作为茶叶中的一种有效成分，具有抗病毒、抗氧化、抑菌消炎等功能[1]，在体内外试验中被证实具有广泛的抗癌活性，其抗癌机理包含诱导细胞凋亡、调控细胞周期、阻滞细胞转移、协同抗癌等[2]。近年来对其功效的研究日趋深入和完善，被广泛用于食品、保健品和日化领域。本研究通过对高纯度EGCG的提取、分离纯化工艺的探讨，为放大生产EGCG提供参考，对提高湖北省秋茶的利用率具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 茶叶原料 茶叶原料来自湖北省农业科学院果树茶叶研究所茶叶资源圃种植的鄂茶1号、鄂茶5号、鄂茶8号、中茶108和福鼎大白。

1.1.2 试验试剂 乙醇为分析纯（国药集团化学试剂有限公司），冰醋酸、乙腈为色谱纯（美国Fisher Chemical）。

1.2 试验方法

1.2.1 原料筛选 在前人研究基础上[3]，选择EGCG含量相对较高的茶叶资源作为试验原料。采摘一芽二叶（采摘日期为2015年8月6日），100 ℃纯水蒸制3 min，100 ℃烘至足干，茶样粉碎后过40目筛，分别称取3 g，加入500 mL水，100 ℃浸提45 min，得到的滤液定容至500 mL，HPLC法检测其EGCG含量。

1.2.2 EGCG的提取 单因素试验：按照茶多酚提取方法，浸提温度选取40、50、60、70、80、90、100 ℃，浸提时间选取30、40、50、60、70、80、90 min，浸提料液比选取1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20（g/mL，下同），以此研究各因素的影响作用。

正交试验：通过单因素试验，分析各因素对EGCG浸出量的影响，确定较佳的单因素试验条件范围，在此基础上，以浸提温度、浸提时间、料液比为主要影响因素，各选出4个水平，安排L16（43）正交试验分析。

1.2.3 EGCG的分离纯化 树脂的预处理：树脂在使用之前需要进行有效的预处理，以除去制备和贮存中引入的杂质。一般预处理的方法是：①乙醇浸泡。树脂浸泡在95%左右浓度的乙醇中，乙醇的液面高于树脂，不停搅拌以使树脂和乙醇充分接触，对树脂进行初步的浮选。浸泡时间一般为24 h。②乙醇冲洗。浸泡后的树脂湿法上柱，再用95%的乙醇冲洗，直至流出液清亮无浑浊为止。③3%的氢氧化钠溶液的浸泡和冲洗。先将经乙醇浸泡冲洗过的树脂浸泡于3%的氢氧化钠溶液中4 h，再以2 BV 3%的氢氧化钠溶液冲洗树脂，最后用蒸馏水冲洗至中性。④5%的柠檬酸冲洗。先将经3%的氢氧化钠溶液浸泡冲洗过的树脂浸泡于5%的柠檬酸溶液中4 h，再以2 BV 5%的柠檬酸冲洗树脂，最后用蒸馏水冲洗至中性[4]。

树脂的筛选：在刘伟等[5]、王伟涛等[6]研究基础上，选择AB-8、HPD-826和聚酰胺三种树脂。根据前期研究发现，树脂在使用3～15次时柱效稳定、分离效果较佳，故选取使用过2次的3种树脂各8 g，分别置于500 mL的具塞磨口烧瓶中，加入2%浓度的原茶汤400 mL，在恒温摇床（30 ℃、140 r/min）上充分吸附2 h，考察树脂对EGCG的吸附量。冰箱中静置约12 h后过滤，滤液中加入200 mL 80%的乙醇，在恒温摇床上充分解吸2 h，得解吸液。将以上的原茶汤、吸附后茶汤残留液和解吸液各用移液管吸取5 mL，定容至50 mL，进行HPLC分析检测，并按下式分别计算吸附量和解吸率：

Q=■；E=■

式中，Q为吸附量（mg/g），M为去游离水的树脂质量（g），E为解吸率，V1为茶汤原始体积，V2为80%乙醇洗脱液体积，C1为原茶汤溶液浓度（mg/mL），C2为树脂吸附后剩余茶汤残留液浓度（mg/mL），C3为80%乙醇洗脱液浓度（mg/mL）。

洗脱剂浓度的选择：选用筛选到的树脂，茶汤（500 mL，浓度为20 mg/mL）上柱流速控制在1 BV/h，上柱后静态吸附2 h，开展解吸试验。先研究水洗量对咖啡因和EGCG含量的影响，再分别制备乙醇浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的洗脱液，解吸流速控制在1 BV/h，研究EGCG和咖啡因在树脂中的乙醇梯度洗脱的含量变化。

1.3 高效液相色谱分析检测方法

色谱柱为PhenomenexGemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相A：0.2%乙酸水溶液（V/V），流动相B：乙腈。流速：0.8 mL/min；检测波长：278 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。标准曲线：准确称取EGCG标准样品，溶于一定量的25%乙腈水溶液中，分别配制成不同浓度梯度的标准溶液，根据EGCG标样及相对保留时间作为定性方法，以峰面积计算其含量，工作曲线Y=11 004 641.426X-528 274.199。其中Y为峰面积；X为样品浓度（mg/mL）。洗脱梯度见表2。

2 结果与分析

2.1 原料筛选

表3为不同茶叶资源中EGCG的含量。由表3可见，鄂茶1号中EGCG含量相对较高，可用作提取分离纯化高纯度EGCG单体的原料。

2.2 EGCG的提取

2.2.1 单因素试验结果 图1表明，浸提液中EGCG的含量随着浸提温度的升高先升后降，分析其原因为浸提以扩散原理为基础，随温度升高，扩散速度加快，浸提液中EGCG含量有所增加，但当温度到达一定值后，EGCG的氧化速度也加快，含量反而有所下降。

图2表明，浸提液中EGCG的含量随着浸提时间的延长先升后降，分析其原因为固-液浸提过程为三步[7]：①溶剂进入固体内部，溶质溶解；②溶质从固体内部到表面；③溶质溶解液从固体表面到溶剂中。这个过程需要一定的时间，在这个时间范围内，随浸提时间的延长，EGCG浸出量增加，但当浸提时间到达一定值后，因温度原因EGCG的氧化速度加快，含量反而有所下降。

图3表明，在选取的料液比范围内随着浸提用水量的增加，浸提液中EGCG含量一直呈上升趋势，但当料液比达到1∶16后，再增加浸提用水量，对EGCG的浸出影响不大，分析其原因为茶粉中所含的EGCG量是一定的，当浸提用水量到达一定值后，茶粉中EGCG已全部浸提出，再增加用水量EGCG也没有明显增加，反而会因温度等原因加快EGCG的氧化，同时给后续吸附、解吸和浓缩处理增加能耗，提高生产成本。

2.2.2 正交试验确定浸提茶多酚和EGCG的最佳条件 根据单因素试验结果，浸提温度选取60、70、80、90 ℃，浸提时间选取40、50、60、70 min，浸提料液比选取1∶14、1∶16、1∶18、1∶20，正交分析结果见表4和表5。

由表4可知，最佳浸提工艺组合为A2B3C4，即浸提温度70 ℃，浸提时间60 min，料液比1∶20，此条件下茶汤中EGCG含量为9.041%。由表5可知，浸提温度和料液比对浸提液中EGCG含量的影响显著，浸提时间对浸提液中EGCG含量的影响不显著。

2.3 EGCG的分离纯化

2.3.1 树脂的筛选结果 由表6可见，聚酰胺树脂优于其他两种，可用于较好地分离纯化茶汤中的EGCG单体。分析其原因是聚酰胺树脂具有的酰胺基与EGCG分子上的酚羟基进行氢键缔合能产生较好的吸附作用，用高浓度乙醇洗脱时解吸率也较高。

2.3.2 洗脱梯度选择 浸提液上柱完成后先用纯水洗脱，这是因为咖啡因属于嘌呤生物碱，在溶剂中作为氢键受体，不易与聚酰胺树脂形成较强吸附作用，而EGCG的酚羟基与聚酰胺树脂的酰胺基具有很好的氢键结合力，所以用纯水冲洗时，水洗量对EGCG的含量几乎无影响，对咖啡因的解吸效果影响比较明显。由图4可见，解吸液中咖啡因含量随水洗量的增加呈现先升后降的趋势，且在500 mL水洗量（1 BV料液）的时候咖啡因的含量达到最高。

由图5可知，解吸液中EGCG含量随着乙醇浓度的提高而升高，乙醇浓度为80%时达到最高，而后稍降低，分析其原因为乙醇分子中的羟基与EGCG分子中的酚羟基有很强的氢键结合力，有效取代了聚酰胺树脂与EGCG分子的结合，但是聚酰胺树脂结合的EGCG分子数量是一定的，所以当乙醇浓度到达一定值后，过剩的乙醇分子开始结合除EGCG以外的其他分子，导致解吸液中EGCG含量反而有所下降。

由图6可见，咖啡因含量随着乙醇浓度的提高而降低，当乙醇浓度达到70%以后，变化微小。分析其原因为低纯度乙醇溶液中极性和非极性分子同时大量存在，可充分洗脱出树脂柱中的咖啡因，随乙醇浓度增加，极性分子含量增多，非极性分子含量减少，咖啡因的解吸量反而下降。

綜合图4、图5和图6的结果，从产品的品质和成本考虑，选用梯度洗脱：先用1 BV的纯水洗脱，再用1 BV 20%乙醇洗脱，最后用1 BV 80%乙醇洗脱，所得解吸液经悬转蒸发浓缩后冷冻干燥，但试验最终得到的EGCG单体纯度仅为90.87%。为解决产品纯度问题，考虑两次上柱纯化的方案，最终得到纯度为95.21%的EGCG单体，但得率仅为0.276%。

3 小结与讨论

3.1 结论

湖北省广泛种植的5种茶叶资源中，鄂茶1号的EGCG含量相对较高，可用作提取、分离纯化高纯度EGCG单体的原料。

用纯水浸提，浸提温度70 ℃，料液比1∶20条件下浸提60 min，所得浸提液中EGCG含量最高。

聚酰胺树脂由于其酰胺基能对含酚羟基的EGCG具有较好的吸附作用，且对CAF的选择吸附作用较低，非常符合本试验制备无酯儿茶素产品的要求。聚酰胺树脂纯化儿茶素最佳工艺条件为：上样流速1 BV/h、茶汤浓度为20 mg/mL，解吸流速为1 BV/h，分别用1 BV的水、1 BV 20%的乙醇溶液以及1 BV80%的乙醇溶液进行梯度洗脱。

通过两次柱层析分离纯化，得到的EGCG单体纯度可达95.21%。

3.2 讨论

本研究通过提取、分离纯化工艺的探讨，得到了高纯度EGCG单体，工艺绿色无污染，对提高湖北省秋茶的利用率具有重要意义，但是得率低，成本相对较高。预计从两方面着手开展后续试验：一是扩大高EGCG含量茶叶资源[8]的筛选范围，从湖北省扩大到全国；二是进一步筛选合适的树脂，力求一次柱层析可分离纯化得到95%纯度的EGCG单体，减少损耗，提高得率。

参考文献：

[1] SINGH B N，SHANKAR S，SRIVASTAVA R K.Green-tea-catechin，epi-gallocatechin-3-gallate（EGCG）：Mechanisms，perspectivesand clinical applications[J].Biochem Pharmacol，2011，82：1807-1821.

[2] 刘 飞，熊政委，李春华.表没食子儿茶素没食子酸酯分子修饰及抗癌研究进展[J].食品科学，2015，36（23）：321-328.

[3] 金孝芳，贾尚智，石亚亚，等.湖北省地方审定茶树品种中儿茶素含量分析[J].浙江农业学报，2014，26（1）：67-71.

[4] 颜栋美，李仁菊.膜分离和聚酰胺吸附对金花茶多酚的纯化[J].食品与机械，2010，26（1）：42-43，91.

[5] 刘 伟，陈 茜，周 洁，等.柱色谱分离制备无酯儿茶素[J].食品工业科技，2012，33（18）：58-62.

[6] 王伟涛，马朝阳，陈尚卫，等.吸附柱层析法制备纯化茶多酚中 EGCG单体[J].天然产物研究与开发，2014（10）：1647-1653.

[7] 崔继来，华 飞，龚正礼.速溶绿茶粉浸提工艺参数优化[J].食品科学，2011，32（12）：130-132.

[8] 唐晓波，刘晓军，王小萍.高EGCG茶树品种的筛选及开发[J].浙江农业科学，2010（1）：60-61.