柴芩承气汤对急性胰腺炎大鼠肺泡巨噬细胞PERK基因表达的影响

王昊阳，郭 佳，骆瑞杰，夏 庆，薛 平

四川大学华西医院 中西医结合科(成都 610041 )

柴芩承气汤对急性胰腺炎大鼠肺泡巨噬细胞PERK基因表达的影响

*王昊阳，郭 佳，骆瑞杰，夏 庆，薛 平△

四川大学华西医院 中西医结合科(成都 610041 )

目的 探讨柴芩承气汤(Chai Qin Cheng Qi decoction，CQCQD)对急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)大鼠肺泡巨噬细胞内质网双链RNA 依赖蛋白激酶样ER激酶(PKR-like ER kinase, PERK)mRNA表达的影响。方法 将30只SD大鼠随机分成对照组、AP组及CQCQD组(n=10)。AP组采用20%L-精氨酸腹腔注射(2.5 g·kg-1·1h-1×2)制作；CQCQD组分别于第0、2、4 h 用CQCQD按0.2 mL/100 g灌胃，对照组采用生理盐水代替CQCQD灌胃，容积及方法与CQCQD组同。于6 h收集胰腺组织行病理检查，肺泡巨噬细胞检测PERK的mRNA表达，血清检测大鼠血清IL-6及TNF-α水平。结果 AP组胰腺组织病理评分(8.8±0.5)分，高于对照组(1.0±0.3)分及CQCQD组(5.4±0.6)分(P<0.05)；CQCQD组血清IL-6及TNF-α(48.3±10.7 pg/mL，35.1±14.5 pg/mL)高于对照组(35.1±10.6 pg/mL，21.3±14.2 pg/mL，P<0.05)，但低于AP组血清(67.5±13.1 pg/mL，52.1±13.7 pg/mL，P<0.05)。与对照组比较，AP组巨噬细胞PERK mRNA表达上调，CQCQD灌胃可下调其表达(P<0.05)。结论 CQCQD减少炎性因子释放可能与下调巨噬细胞内质网PERK mRNA表达有关。

柴芩承气汤； 双链RNA 依赖蛋白激酶样ER激酶； 急性胰腺炎； 巨噬细胞

全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)不但是重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)早期重要的病理生理特征，还是导致多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的主要原因之一[1]。减少促炎因子释放可缓解SIRS。作用于胆碱能抗炎通路可在转录后蛋白合成水平减少巨噬细胞释放促炎因子，但机制尚不明了。近年的研究[2]已证实，当mRNA翻译增多时，可激活内质网肌醇需酶(inositol requiring enzyme 1α，IRE1α)、激活作用转录因子(activating transcription factor 6, ATF6) 及双链RNA 依赖的蛋白激酶样ER 激酶(PKR-like ER kinase, PERK)所介导的3条内质网未折叠蛋白响应信号通路，增强内质网的蛋白加工处理能力。我们前期研究已经证实柴芩承气汤(Chai Qin Cheng Qi decoction，CQCQD)可减少急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)患者血清促炎因子水平。新近研究[3-4]发现，CQCQD作用于胆碱能抗炎通路能够上调AP巨噬细胞烟碱型乙酰胆碱受体α7(nicotinic acetylcholine receptor α7, nAChRα7)及IRE1的表达，减少AP炎性介质释放，缓解AP胰腺病理损害[3]，但对PERK是否有影响，目前尚无研究。因此，本研究拟采用动物实验，探讨CQCQD对AP大鼠肺泡巨噬细胞PERK mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

体质量250～300 g 的SD雄性健康成年大鼠，由四川大学华西医学中心实验动物中心提供。

1.2 药物

CQCQD组成[4]: 柴胡15 g，黄芩15 g，厚朴15 g，枳实15 g，茵陈15 g，栀子20 g，大黄20 g( 后下)，芒硝20 g ( 冲服)。将中药用清水500 mL浸泡1 h，然后用煎药机煎0.5 h，煎出药液200 mL。由四川大学华西医学中心生化教研室制作成冻干粉。实验前用注射用水按3.0 g/mL生药配制备用。

1.3 试剂

L-精氨酸(BCB09906V，Sigma，美国)；Trizol购至美国invitrogen公司(批号：50563209)；Taq DNA PCR反应试剂盒由TAKARA大连宝生生产(批号：ck3501AA)；dNTP购至美国普洛麦格(Promega)公司(批号：251230)；逆转录试剂盒购至EU Fermentas 公司(批号：00098448)；DNA分子量标准(DNA Marker)购至北京康为世纪公司(批号：16911K)；电泳级琼脂糖购至GENE TECH上海有限公司(批号：111760)；其他实验室常备试剂均为国产分析纯。测序：上海生工生物工程有限公司；引物设计网站：www.ncbi.nlm.nih.gov。

1.4 仪器

FTC2000实时荧光定量基因扩增仪为加拿大枫岭(FUNGLYN)公司生产；MSE Micro-Centaur Centrifuge微型台式离心机为日本Sanyo公司生产；水平电泳仪(MODEL 200/2.0，BIO-RAD，USA)；水平离心机LD5-2A为北京医用离心机厂生产；Gel Doc 1000 凝胶成像系统(Gel Doc,BIO-RAD，USA)；其他实验室常备器皿、耗材均为国产优质品。

1.5 AP模型制作

实验前，大鼠适应性喂养7 d，造模前禁食12 h，但不禁水。AP模型采用20%的L-精氨酸2.5 g/kg腹腔注射，1 h后再次注射相同剂量L-精氨酸，24 h后造模成功；假模型采用相同溶剂的生理盐水代替L-精氨酸，给药剂量及方法与AP模型同。

1.6 分组及标本收集

采用数字随机法，将30只健康成年SD大鼠随机分成对照组、AP组及CQCQD组(n=10)。AP组及CQCQD组采用AP模型，对照组采用假模型。造模成功后，CQCQD组分别于0、2、4 h用CQCQD按0.2 mL/100 g灌胃；AP组及对照组采用生理盐水代替CQCQD，于6 h从大鼠心脏采血，分离血清，检测IL-6及TNF-α；分离肺巨噬细胞检测PERK的mRNA表达变化；同时取胰腺组织进行病理评分。

1.7 肺泡巨噬细胞收集

采用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，固定大鼠，艾利克消毒，延胸骨剪开胸腔，取右肺下叶，寻及气管，插入管喂器并固定，注入PBS液5～8 mL，快速反复抽吸10次后，收集肺泡灌洗液；将获得的肺泡灌洗液以800 r/min离心10 min，去上清，再加入PBS液10 mL，用移液枪吹打混匀，再以800 r/min离心10 min，去上清，获得肺泡巨噬细胞，备用。

1.8 肺巨噬细胞内质网PERK的mRNA检测

灌胃6 h 后，取大鼠右下肺收集巨噬细胞。总RNA提取采用Trizol 试剂2 mL冰上提取；所用探针、内参基因及引物均购至上海生物科技有限公司。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因作为内参基因( β-actin) ，测PERK的mRNA。PERK探针:5′-CGC AGGCTTTTCCATCCTC-3′; 上游引物:5′- CTG CACTGGTGGAAGGAAAT-3′; 下游引物:5′-CA CTGAGTTTCAGACTCCTT -3′。β-Actin 探针: 5′-CTGTCCACCTTCCAGCAGA-3′; 上游引物: 5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT3′; 下游引物: 5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′。共进行45个循环的扩增反应，反应完成后，系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数(DRn)进行分析，绘制扩增动力学曲线，从而获得某特定阈值时的扩增循环数(Ct 值)。

1.9 血清 IL-6及TNF-α检测

各组血清IL-6及TNF-α采用ELISA 试剂盒检测，具体操作步骤按试剂盒说明进行。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 各组胰腺病理评分比较

AP组胰腺组织病理评分(8.8±0.5)分，高于对照组(1.0±0.3)分及CQCQD组(5.4±0.6)分(P<0.05)。

2.2 各组血清炎性因子水平比较

CQCQD组血清IL-6及TNF-α水平高于对照组，但低于AP组(P<0.05)(表1)。

表1 各组血清IL-6及TNF-α比较

注：与对照组及CQCQD组比较，aP<0.05; 与对照组及AP组比较，bP<0.05

2.3 PERK mRNA表达

3组内参基因β-actin的Ct值比较差异无统计学意义 (P>0.05)；但AP组PERK基因的Ct值低于对照组和CQCQD组(P<0.05)。提示AP组PERK mRNA表达相对于对照组上升，CQCQD可下调PERK mRNA表达(表2)。

表2 各组PERK及β-actin mRNA的Ct值比较

注：与对照组及CQCQD组比较,aP<0.05； 与AP组相比较，bP<0.05

3 讨论

随着对SAP急性期SIRS发病机制研究的深入，以及临床救治技术水平不断提高，SAP急性期SIRS的治疗效果有了一定改善，但西医TNF-α抗体等单纯的抗炎治疗，仍未能取得理想的临床疗效，遇到了不能及时缓解SIRS的瓶颈。近年来，国内在西医治疗的基础上，采用大承气汤加减化裁而来的CQCQD、清胰汤等中药汤剂治疗SAP取得了很好的临床疗效，基础研究亦取得了一定进展，也逐渐得到国内外学者的认可，但对其疗效机制尚未完全明了。

CQCQD是四川大学华西医院中西医结合治疗SAP急性期疗效确切的临床验方[5]。该方由大承气汤加减化裁而来。其有效成分是生大黄、芒硝、枳实、厚朴、栀子、茵陈蒿、柴胡和黄芩。其中大黄具有抑制酶活性、抗菌、通便和解除胆道oddi括约肌痉挛的作用,且具有活血化瘀、改善微循环、清除位于胃肠道内细菌与毒素,以及改善胃肠黏膜血液循环的功效[8]。同时，大黄也能够降低严重创伤、休克和感染等患者应激性肠黏膜病变、多器官功能失调综合征的发病率,可以显著降低多器官功失调综合征患者血浆TNF-α和内毒素含量, 显著提高SAP的治愈率[9]。厚朴中含厚朴酚, 有治疗实热内蕴、腑气不通之功效；芒硝咸寒润下、泻热通里,有利黄疸消退[10]。枳实可行气消痞；栀子有除烦泻火,清热利尿,凉血解毒,散瘀血的作用；茵陈蒿清热利湿；柴胡和解少阳；黄芩泻实火，除、湿热，止血安胎[11]。

胆碱能抗炎通路中，减少巨噬细胞促炎因子释放的作用靶点是转录后水平。我们近年来的研究重点是CQCQD对巨噬细胞内质网功能的影响。课题组前期研究[6]已经证实，CQCQD可下调巨噬细胞内质网IRE1表达，减少促炎因子释放，但是否同时也作用于PERK介导的通路，尚未研究。本研究发现，L-精氨酸诱导的AP大鼠肺泡巨噬细胞PERK mRNA表达上调，血清IL-6及TNF-α水平升高(P<0.05)；管喂CQCQD后，AP大鼠肺泡巨噬细胞PERK mRNA表达下调，且血清IL-6及TNF-α水平和胰腺病理评分也较AP组明显降低(P<0.05)。提示AP血清促炎因子升高可能与巨噬细胞存在PERK mRNA表达上调有关；CQCQD降低鼠血清IL-6水平和血清TNF-α水平，减轻胰腺病理损害，可能与下调巨噬细胞内质网的PERK mRNA表达，抑制UPR信号传导有关，但具体作用机制尚需进一步研究。

综上所述，CQCQD可下调巨噬细胞PERK mRNA表达，作用于内质网UPR，在转录后水平减少IL-6及TNF-α等促炎因子释放，缓解AP大鼠胰腺病理损害。但具体作用机制尚需进一步研究。

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Effect of Chai Qin Cheng Qi Decoction on the Expression of mRNA of PKR-like ER Kinase of the Endoplasmic Reticulum of Alveolar Macrophages in Rats with Acute Pancreatitis

WangHaoyang,GuoJia,LuoRuijie,XiaQing,XuePing△.

DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,WestChinaHospitalofSichuanUniversity,Chengdu610041,China

Objective To investigate the effect of Chai Qin Cheng Qi Decoction (CQCQD) on the mRNA expression of PKR-like ER kinase (PERK) of the alveolar macrophage (AM) in rats with acute pancreatitis (AP). Methods Thirty Sprague-Dawley (SD) rats were randomised into the control group, AP group and CQCQD group, and each group consisted of 10 SD rats. The rats in the AP group were given intraperitoneal injection with 20%L-arginine (2.5 g·kg-1·1 h-1×2), those in the CQCQD group were treated with CQCQD 0.2 mL/100g by gavage for three times with 2-hour intervals every time, and the rats in the control group were treated with saline in the same way as those in the CQCQD group. After 6 hours of the treatment, the pancreatic tissues were collected for pathological examination, the alveolar macrophage was examined to detect the mRNA expression of PERK, and the serum was assayed to determine the levels of IL-6 and TNF-α. Results The pancreatic histopathologic score of the AP group (8.8±0.5) was significantly higher than that of the control group (1.0±0.3) and that of the CQCQD group (5.4±0.6) respectively (P<0.05). The levels of serum IL-6 and TNF-α in the CQCQD group (48.3±10.7 pg/mL, 35.1±14.5 pg/mL) were significantly higher than those in the control group (35.1±10.6 pg/mL, 21.3±14.2 pg/mL) respectively (P<0.05), but they were significantly lower than those in the AP group (67.5±13.1 pg/mL, 52.1±13.7 pg/mL) respectively (P<0.05). Compared with the control group, the expression levels of PERK mRNA in the AP group were significantly up-regulated (P<0.05), while those in the CQCQD group were significantly down-regulated after the treatment (P<0.05). Conclusion The mechanism of reducing the serum IL-6 and TNF-α by CQCQD may be correlated with the down-regulation of the mRNA expression of PERK in the alveolar macrophage.

Chai Qin Cheng Qi Decoction; PKR-like ER kinase; Acute pancreatitis; Alveolar macrophage

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170111.1047.012.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.01.004

国家自然科学基金(No. 81403252、No. 81573766)

R285.5

A

△通信作者： 薛平，E-mail：duburongcheng@163.com