Wnt/β-catenin及p38MAPK信号通路在人胃癌组织中的表达情况与化学治疗预后及多药耐药相关性研究

孙 纲，韩大跃△，关宏伟，隋 欣，付大鹏

1.解放军第210医院 (大连 116021)；2.大连医科大学附属第一医院(大连 116011)

Wnt/β-catenin及p38MAPK信号通路在人胃癌组织中的表达情况与化学治疗预后及多药耐药相关性研究

孙 纲1，韩大跃1△，关宏伟2，隋 欣1，付大鹏1

1.解放军第210医院 (大连 116021)；2.大连医科大学附属第一医院(大连 116011)

目的 研究Wnt/β-catenin及p38MAPK信号通路在人胃癌组织中的表达规律及其与患者病理情况、化疗后预后生存期情况、相关多药耐药因子之间相关性。方法 选取2007年11月至2013年7月大连医科大学附属第一医院胃癌根治术后病例共91例，应用免疫组化法，对已行胃癌根治术、相同化疗、随访的91名病例的病理标本进行检测，收集Wnt/β-catenin及p38MAPK表达情况和患者一般及病理情况、多药耐药因子ToPoⅡ和GST-π表达情况、预后生存期情况，并进行相关性分析。结果 Wnt/β-catenin及p38MAPK阳性表达率与年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤分期无相关性；相同化疗后，中位生存时间Wnt/β-catenin阴性表达患者(26.5个月)比阳性表达患者(14.9个月)延长(P<0.05)， p38MAPK阳性表达患者(29.1个月)比阴性表达患者(9.2个月)延长(P<0.05)，经Log-Rank分析,Wnt/β-catenin阳性表达率与患者预后生存期呈负相关，p38MAPK阳性表达率与患者预后生存期呈正相关(P<0.05)；p38MAPK阳性表达率分别与ToPoⅡ及GST-π阳性表达率呈正相关及负相关性(P<0.05)，而Wnt/β-catenin阳性表达率与二者均无相关性(P>0.05)；Wnt/β-catenin与p38MAPK阳性表达率之间无相关性(P>0.05)。结论 Wnt/β-catenin及p38MAPK阳性表达率与年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤分期无关；Wnt/β-catenin阳性低表达及p38MAPK阳性高表达与胃癌化疗预后生存期成正相关，可能降低了化疗药物的多药耐药性。

Wnt/β-catenin信号通路；p38MAPK信号通路；人胃癌； 多药耐药

尽管规范化的胃癌根治性手术及术后化学治疗方案已在临床广泛推广及应用，但疗效仍不乐观。排除手术操作的局限性和不可预知性，肿瘤细胞本身对化学药物的多药耐药特性也是严重影响预后的主要因素，多药耐药是肿瘤细胞先天或后天具有对某种抗肿瘤药物的耐药特性，而且可能对其他结构特征、干扰机制、靶目标不尽相同的其他类型抗肿瘤药物具有耐药特性。鉴于多药耐药的发生是多因素共同作用结果，可能存在各种信号通路及蛋白异常。选取近年来肿瘤多药耐药的研究热点，既具备调节消化道肿瘤的发生、发展、侵袭作用,又参与调控肿瘤对化学药物的多药耐药反应的Wnt/β-catenin及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路，采用免疫组化的实验方法,研究人胃癌患者组织中上述两种信号通路的表达情况与患者的病理情况、经过相同化学治疗方案治疗后的预后情况和已知的多药耐药因子拓扑异构酶Ⅱ(ToPoⅡ)(多药耐药不利因素)及谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)(多药耐药有利因素)[1]表达情况之间的相关性,以探讨人胃癌组织中Wnt/β-catenin和p38MAPK信号通路与化学治疗预后及多药耐药之间的相关性，为今后通过单独或联合调控Wnt/β-catenin和p38MAPK信号通路，以便为影响肿瘤多药耐药的作用机制提供理论研究基础。

1 资料及方法

1.1 临床资料

随机选取2007年11月至2013年7月大连医科大学附属第一医院胃癌根治术后病例，手术前及手术中无明显远处转移证据，其临床、病理资料完整；手术后均按奥沙利铂、亚叶酸钙、5-Fu联合方案行化学治疗4疗程；具备规范、系统的随访；排除非癌性死亡病例。最终入选病例数为91例，其中，男59例，女32例；年龄38～85岁，平均年龄52岁,中位年龄68岁，其中，>60岁42例，50～60岁33例，<50岁16例。定期随访数据完整。入选病例病理石蜡标本切片备用。

1.2 方法及主要试剂

将入选病例病理石蜡标本切片逐步常规处理后，采用MaxVision/HRP 免疫组化染色并进行检测。主要试剂分别采用北京普利莱基因技术有限责任公司浓缩型鼠抗人β-catenin单克隆抗体、上海酶联生物研究所p38鼠抗人单克隆抗体、上海亿欣生物科技有限公司ToPoⅡ鼠抗人单克隆抗体、上海沪震实业有限公司GST-π鼠抗人单克隆抗体、北京中杉生物技术开发公司HRP 辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗，已知阳性平片作对照。

1.3 判定标准

Wnt/β-catenin主要表达于胞浆和细胞膜；p38MAPK主要表达于胞浆；ToPoⅡ主要表达于细胞核；GST-π主要表达于细胞质。以上染色成棕黄色颗粒状且肿瘤间质不染色，定为阳性，其中，阳性细胞占75%～100%标记为(+++)；阳性细胞占25%～74%标记为(++)；阳性细胞占5%～24%标记为(+)；阳性细胞占0%～4%标记为(-)[2](图1)。

1.4 数据收集

收集各病例Wnt/β-catenin、p38MAPK、ToPoⅡ、GST-π的表达情况，并根据判定标准进行统计；收集患者年龄、性别、入选病例肿瘤组织学分级及临床分期(AJCC第7版分期)的分布情况；收集化学治疗后患者生存期(中位生存时间)。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 人胃癌组织中Wnt/β-catenin、p38MAPK的阳性表达情况以及与患者一般情况及病理情况之间的相关性

从入选病例Wnt/β-catenin阳性表达情况可发现,Wnt/β-catenin总阳性表达率为74.7%(68/91)，但经秩和检验发现，Wnt/β-catenin阳性率的分布与患者年龄、性别、肿瘤组织学分级、肿瘤临床分期无相关性(P>0.05)。从入选病例p38MAPK阳性表达情况可发现，p38MAPK总阳性表达率为80.2%(73/91)，但经秩和检验发现，p38MAPK阳性率的分布与患者年龄、性别、肿瘤组织学分级、肿瘤临床分期无相关性(P>0.05)(表1)。

图1 Wnt/β-catenin 、p38MAPK、ToPoⅡ、GST-π表达情况

注：A. Wnt/β-catenin表达阳性(×400)；B.p38MAPK表达阳性(×400)；C.ToPoⅡ表达阳性(×400)；D.GST-π表达阳性(×400)

表1 Wnt/β-catenin、 p38MARK在人胃癌组织中的表达与各病理因素的关系[n(%)]

2.2 人胃癌组织中Wnt/β-catenin、p38MAPK阳性表达情况与预后生存期之间的关系

Wnt/β-catenin阴性表达患者中位生存期(26.5个月)高于Wnt/β-catenin阳性表达(包括+、++、+++)患者中位生存期(14.9个月)(P<0.05)， p38MAPK阳性表达(包括+、++、+++)患者中位生存期(29.1个月)高于p38MAPK阴性表达患者中位生存期(9.2个月)(P<0.05)；同时,经Log-Rank单因素相关性分析，Wnt/β-catenin阳性低表达及p38MAPK阳性高表达均可能是对肿瘤化学治疗预后生存期的有利因素，可能是对肿瘤化学治疗药物多药耐药的不利因素(P<0.05)(表2)。

表2 胃癌患者(Wnt/β-catenin)/(p38MAPK)表达情况与经化学治疗后生存期单因素相关性分析

2.3 人胃癌组织中Wnt/β-catenin、p38MAPK阳性表达情况与已知多药耐药因子ToPoⅡ、GST-π阳性表达情况之间的相关性本研究中，ToPoⅡ总阳性表达率为49.5%(45/91)，其中，10例为(+++)，11例为(++)，24例为(+)，46例为(-)； GST-π阳性表达率76.9%(70/91)，其中，30例为(+++)，27例为(++)，13例为(+)，21例为(-)。

人胃癌中Wnt/β-catenin阳性表达率与ToPoⅡ及GST-π阳性表达率之间无相关性(P>0.05)；人胃癌中p38MAPK阳性表达率与ToPoⅡ阳性表达率呈正相关性(r=0.227，P=0.003)，而与GST-π阳性表达率呈负相关性(r=-0.254 ，P=0.005)；Wnt/β-catenin阳性表达率与p38MAPK阳性表达率之间无相关性(P>0.05)。

鉴于ToPoⅡ和GST-π为已知的影响多药耐药因素，且ToPoⅡ为不利因素，GST-π为有利因素,由此得出，p38MAPK高表达可能是对肿瘤化学治疗药物耐药的不利因素。

3 讨论

胃癌是严重威胁人类健康的疾病之一，位居我国城市居民恶性肿瘤死因第3位，且发病率有升高趋势[3]。因胃癌发病初期临床特异性症状不明显，患者投入关注力不足，易于漏诊及误诊。目前，确诊后多采用以根治性手术及化学治疗为主要手段的综合治疗，并制定了如NCCN的治疗指南。尽管近年来，临床及基础研究已取得了十足发展，大量新兴手术技术、治疗方法及更有效的抗肿瘤药物[4]逐步出现并应用，但胃癌的综合预后仍不理想，转移、复发和死亡率很高。而化学治疗作为胃癌治疗中的关键一环，多用于化学治疗初期，疗效明显，敏感性较高，治疗后期却出现平台期，甚至药物敏感性明显降低，即使更换治疗方案也效果甚微。这种情况多归因于恶性肿瘤细胞的多药耐药效应。多药耐药的发生机制较为复杂，已知可能的原因为：1)跨膜转运引起的药物分子细胞内外分布失调，导致药物分子外泄；2)调节细胞器靶点分布，从而隐藏药物靶点；3)LRP的类膜泵效应胞吐药物分子；4)细胞的自我修复过表达；5)细胞的药物靶点突变，降低其对药物敏感性；6)PKC 过表达，促进相关蛋白磷酸活化；7)凋亡基因的影响等[5-6]。同时，多种信号通道及蛋白参与其中，并起到了绝对作用，如ToPoⅡ可导致核酸结构稳态的破坏，对核酸代谢起到重要作用，影响基因重组、转录等，引起多药耐药；GST-π是一种具有灭毒与结合蛋白功能的同工酶，它不仅可以与亲脂性细胞毒药物结合增强其水溶性，还可以促进细胞的自我修复，引起多药耐药。

Wnt/β-catenin信号通路是基于胞外Wnt蛋白、胞内β-catenin蛋白及其下游因子以及胞膜上的受体共同组成的信号通路。β-catenin是一种多功能、可溶性糖蛋白，是细胞内糖蛋白家族成员之一，具有激活Wnt作用，当非磷酸化的β-catenin可由胞浆聚集后转入细胞核内后，顺序激活下游因子，影响肿瘤细胞的生理过程、转录顺序、耐药靶点变异、拮抗经典途径和细胞骨架重排等[7-8]，进而导致肿瘤细胞多药耐药发生。与此同时，活化后的Wnt基因可保护非磷酸化β-catenin 不被降解，加速上述影响发生。根据文献[9]报道，Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤发生、发展、耐药等方面起着重要作用。

p38MAPK信号通路是组成MAPK 信号通路的重要一环，其本质是真核细胞内的一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能被多种信号特别是丝裂原刺激激活，进而引起细胞内生理、病理的多种信号双向传导，影响细胞增殖、分化、转化、凋亡等，其在肿瘤细胞的产生、发展、浸润、转移、复发和多药耐药过程中均起到重要作用。同时，活化的p38MAPK可通过干扰肿瘤细胞MDR及其蛋白产物的表达、干扰凋亡以及干扰膜转移来进一步影响多药耐药程度。根据文献[10-11]报道，p38MAPK信号通路活性与肿瘤细胞对化疗药物敏感性呈正相关。

从本研究可以得出，Wnt/β-catenin阳性表达率与患者年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤分化程度、肿瘤分期无关，虽与已知选定的多药耐药因子无相关性，但Wnt/β-catenin阳性表达率与胃癌化学治疗预后生存期呈负相关，可能降低了化学治疗药物的多药耐药性；p38MAPK阳性表达情况在人胃癌组织中普遍存在，其阳性表达率与患者年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤分化程度、肿瘤分期无关，与已知多药耐药因子存在相关性，并与胃癌化学治疗预后生存期呈正相关，可能降低了化学治疗药物的多药耐药性；但Wnt/β-catenin和p38MAPK表达率之间无相关性。

综上所述，Wnt/β-catenin信号通路及p38MAPK信号通路阳性表达是人胃癌组织中普遍存在的情况，尽管二者之间无相关性，但Wnt/β-catenin信号通路低表达及p38MAPK信号通路高表达仍是胃癌化学治疗预后的有利因素，也可认为是肿瘤多药耐药的不利因素。同时，需要注意的是，尽管目前对上述信号通道研究较为广泛，但受困于无多中心横向及肿瘤各阶段纵向比较，仍不能完全阐明上述信号通路与肿瘤细胞的多药耐药各环节的普遍规律，特别是相关通路在肿瘤多药耐药过程中的干预机制值得进一步探讨，从而减弱甚至抵消肿瘤的多药耐药特性，提高肿瘤诊治的综合疗效。

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The Correlation of the Expressions of the Wnt/β-catenin and P38MAPK Pathways with the Prognosis of Survival and Multidrug Resistance in Human Gastric Carcinoma

SunGang1,HanDayue1△,GuanHongwei2,SuiXin1,FuDapeng1.

1.The210thHospitalofChinesePeople′sLiberationArmy,Dalian116021,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China

Objective To evaluate the expression of the Wnt/β-catenin and p38MAPK in gastric carcinoma and investigate their relationship with the pathological condition, survival time after thermotherapy, and the related factors of multidrug resistance. Methods 91 patients with gastric carcinoma treated with radical surgery from November of 2007 to July of 2013 in The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University were selected as the research objects. The immunohistochemical method was used to assay the pathological specimen of the 91 patients with the same chemical treatment and the follow-ups. The data including the expressions of β-catenin, p38MAPK, ToPoⅡ and GST-π, the general and pathological condition of patients, and the survival prognosis were collected and analyzed. Results The positive expression rate of β-catenin and p38MAPK was not significantly correlated with age, gender, degree of tumor differentiation, and TNM staging respectively. After the same thermotherapy, the median survival time of the patients with the negative expression of β-catenin (26.5 months) was significantly longer than that of those with the positive expression (14.9 months) (P<0.05), while the median survival time of the patients with the positive expression of p38MAPK was significantly longer than that of those with the negative expression (P<0.05). According to the results of Log-rank analysis, the patients′ survival time after prognosis was negatively correlated with the positive expression rate of β-catenin (P<0.05) and positively correlated with the positive expression rate of p38MAPK (P<0.05); The positive expression rate of p38MAPK was positively correlated with that of GST-π and negatively correlated with that of ToPoⅡ, while the positive expression rate of β-catenin was not correlated with the positive expression rates of p38MAPK and ToPoⅡ respectively; and there were no correlation in the positive expression rate between β-catenin and p38MAPK. Conclusion The positive expression rates of β-catenin and p38MAPK are not correlated with age, gender, degree of tumor differentiation, and TNM staging respectively. The low positive expression of β-catenin and the high positive expression of p38MAPK are positively correlated with the survival time after prognosis and they may reduce the degree of multidrug resistance.

Wnt/β-catenin pathway; p38MAPK pathway; Human gastric carcinoma; Multidrug resistance

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170116.1701.008.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.01.007

R735.2

A

△通信作者：韩大跃，E-mail:handayue210@yeah.net